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徕卡显微镜入射光荧光显微镜里程碑

2018-01-19  发布者:admin 

落射荧光显微镜

约翰·塞巴斯蒂安·普洛姆1927年出生在萨瓦伦托(苏门答腊),是一名荷兰煤矿工程师的儿子。在幼年时期,他和父母一起回到了荷兰,在那里他创作了绘画作为他的激情之一。高中毕业后,他发现了另一个迷人的色彩领域,我们将在稍后学习。普洛姆决定学习医学,并在乌得勒支,哈佛和阿姆斯特丹接受教育。之后他在迈阿密和阿姆斯特丹大学工作,之后被提升为荷兰莱顿医学院的教授。

在他的研究活动中,他发现荧光显微镜是一个强大的工具。在20世纪60年代,特殊类型的标本照明开始流行起来,事实上,早在1925年,Policard和Paillot就已经知道了这种照明,他们对丝虫的自发荧光事件感兴趣(Policard and Paillot,1925)。一些研究人员重新启动了两名法国科学家的项目,将荧光照明和样品检测放在显微镜的同一侧。这种使用入射光的原理被称为“落射照明”“与透射显微镜相反。使用这种技术用于荧光显微镜的一大优点是避免检测由光源传送的发射光(图1)。另一个好处是具有更多的机械特性:在透射照明中,聚光镜和物镜有两个分开的光轴,必须仔细对准。在落射照明中,物镜是:聚光镜和光收集物镜。像这样,可以避免对齐问题。



图1:荧光显微镜中epi-照明的好处:在透射照明(左)的情况下,光源和图像检测位于目标的相反侧。 使用这种设置,一个明显的限制是激发光(浅蓝色)的不必要的检测。 相比之下,Epi-Illumination(右图)使用照明目标以及图像检测。 对于荧光显微镜来说,这意味着用户不会暴露于激发光。

图1:荧光显微镜中epi-照明的好处:在透射照明(左)的情况下,光源和图像检测位于目标的相反侧。使用这种设置,一个明显的限制是激发光(浅蓝色)的不必要的检测。相比之下,Epi-Illumination(右图)使用照明目标以及图像检测。对于荧光显微镜来说,这意味着用户不会暴露于激发光。



分色光束分光镜

几年前苏联的两位研究人员已经提供了荧光落射照明显微镜的一个非常重要的输入。Brumberg和Krylova开发了一种用于入射光紫外激发的所谓二色分光镜(Brumberg and Krylova,1952)。二色性材料能够让某一波长范围的光线通过,而其他波长的光线则被反射(图2)。 

这个原理对于荧光落射照明是不可或缺的,因为激发光必须以某种方式融合到显微镜的光路中(图3)。更确切地说,二向色分束器对于来自光源的期望的激发光的波长是不可穿透的并且将激发光反射到样本。来自样本的荧光又可以将二向色分束器传送到检测侧。



图2:透射图说明了二向色分束器的功能。 反射较短波长的光(蓝色箭头),较长波长的光(红色箭头)可以通过滤波器。

图2:透射图说明了二向色分束器的功能。反射较短波长的光(蓝色箭头),较长波长的光(红色箭头)可以通过滤波器。

图3:荧光落射照明需要能够将激发光(蓝色)反射到样品并将发射光(绿色)传递到检测侧的分色镜(灰色)。 激发光的波长可以用相应的滤光片(橙色)预选。 面向检测侧(紫色)的过滤器专门使荧光团的波长通过,并排除来自激发的剩余杂散光。

图3:荧光落射照明需要能够将激发光(蓝色)反射到样品并将发射光(绿色)传递到检测侧的分色镜(灰色)。激发光的波长可以用相应的滤光片(橙色)预选。面向检测侧(紫色)的过滤器专门使荧光团的波长通过,并排除来自激发的剩余杂散光。



不幸的是,由于铁幕之间缺乏信息交流,普洛姆不知道俄罗斯的发展。尽管如此,他自己也开始使用二色分光镜。在Ploem的特殊情况下,他和着名的特种玻璃Schott(美因茨)生产商一起开发了一种分光镜,它反映了蓝光和绿光(Ploem,1965)。之后,他用Leitz公司提供的中性分束器修改了一个“Opak”落射照明器,通过引入一个带有四个不同二向色分束器的滑块,他可以实现紫外,紫光,蓝色和绿色(Ploem,1967)(图4)。



图4:带有四个分色器的荧光多波长落射照明器,安装在滑块上,用于紫外,紫色,蓝色和绿色激发光的入射照明。 修建在阿姆斯特丹大学(1965年,Ploem)。

图4:带有四个分色器的荧光多波长落射照明器,安装在滑块上,用于紫外,紫色,蓝色和绿色激发光的入射照明。修建在阿姆斯特丹大学(1965年,Ploem)。




荧光滤光激发块

二向色分束器的发展以产生具有离散波长的激发光具有重要的优点。紫外光谱(〜100nm〜380nm)的激发在当时是非常普遍的,但具有恼人的副作用:自发荧光。许多组织物质被紫外光激发,导致微弱的背景发光(图5)。通过将分色镜的反射波长拟合到绿色或蓝色范围,Ploem能够达到在那些时间非常普遍使用的两种荧光染料FITC(494nm )和TRITC(541nm)的激发最大值,而没有产生自发荧光。FITC(荧光素异硫氰酸酯)和TRITC(四甲基罗丹明-5-(和6) - 异硫氰酸酯)可以与抗体偶联,并仍然用于免疫荧光显微术。通过在很小的范围内激发它们的最大值,组织标本的对比度显着增强(图5)。用Ploem的二向色分光镜产生的激发光束如此有效地拟合到FITC的激发最大值,甚至可以使用具有相当差的发射光谱的光源。



图5:左侧:用宽带UV激发照射标记有免疫标记(FITC)的组织细胞。 注意蓝色自体荧光的组织结构。 右:使用窄带蓝(490nm)光照射epi照射的FITC标签具有相同的组织和相同的免疫染色。 注意增加的图像对比度(Ploem,1967)。

图5:左侧:用宽带UV激发照射标记有免疫标记(FITC)的组织细胞。注意蓝色自体荧光的组织结构。右:使用窄带蓝色(490nm)光照射epi照明的FITC标签具有相同的组织和相同的免疫染色。注意增加的图像对比度(Ploem,1967)。



考虑到这些事实,现在有可能通过应用蓝色和绿色的窄带激发,利用普通高压汞弧灯供电,利用落射照明的优点。这种增强满足了即将到来的生命科学和医学荧光显微镜的需求。 

Leitz出于应用Ploem的发明,设计了一种新型的多波长荧光落射照明装置,配有四个旋转的二向色分光镜,可以在紫外线,紫色,蓝色和绿色的光线范围内激发样品:Leitz PLOEMOPAK。

Leitz员工W. Kraft完成了进一步的成就,他将一个二向色分束器与适当的激发和发射过滤器结合在一个工件中,即所谓的过滤器立方体或激发块(Kraft,1969 und Kraft,1972) 6)。他的调查结果是设计了一个落射照明器,其中有几套这样的滤光片立方体,它们仍然是当今所有多波长荧光显微镜的基础。



图6:左图:Leitz员工W. Kraft于1970年左右将激发滤光片(橙色),二向色分光镜(灰色)和发射滤光片(紫色)放在一个工件 - 滤光片立方体中。 中间:过滤器立方体的工程图。 右图:在现代显微镜下,荧光滤光片立方体可以轻松地进出。 研究人员甚至可以根据自己的需要,用不同的滤光片和二向色分光镜来修改立方体。

图6:左图:Leitz员工W. Kraft于1970年左右将激发滤光片(橙色),二向色分光镜(灰色)和发射滤光片(紫色)放在一个工件 - 滤光片立方体中。中间:过滤器立方体的工程图。右图:在现代显微镜下,荧光滤光片立方体可以轻松地进出。研究人员甚至可以根据自己的需要,用不同的滤光片和二向色分光镜来修改立方体。



概要

凭借Ploem及其同时代人和接班人共同构建的技术基础,我们今天享受到通过将足够的滤光片放入落射照明器中观看无数不同荧光团的特权(图7)。研究人员甚至可以建立自己的立方体,根据需要定制激发和发射参数。

由于现代研究显微镜的自动化,在实验过程中切换滤光片立方体不过是点击一个按钮。科学家们可以在不同荧光基团之间切换,因此甚至可以观察到不同基因表达荧光标记的活标本。


图7:荧光显微镜的演变。 左:透射光的荧光显微镜的基本问题是激发光的检测。 中间:这就是为什么人们利用落射照明将光源移动到显微镜的检测侧。 这种方法需要一个二向色分束器。 右图:将激发滤光片,发射滤光片和二向色分光镜组合成一个区块便于快速切换专用于某些荧光团的不同区块。

图7:荧光显微镜的演变。左:透射光的荧光显微镜的基本问题是激发光的检测。中间:这就是为什么人们利用落射照明将光源移动到显微镜的检测侧。这种方法需要一个二向色分束器。右图:将激发滤光片,发射滤光片和二向色分光镜组合成一个区块便于快速切换专用于某些荧光团的不同区块。




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