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徕卡显微镜激光显微切割系统和Qiagen公司试剂盒成功分析RNA

2015-07-13  发布者:admin 

激光显微切割(LMD)允许分离单个细胞或染色体,是一个完善的技术通过PCR或测序技术的核酸含量样品制备之前下游分析。在这里,我们描述甚至很少量的徕卡LMD系统和Qiagen公司试剂盒核酸纯化的成功结合。所呈现的工作流程和协议提供成功的LMD应用的基础,而不的核酸量和剩余的RNA的完整性的过程强调产品的高品质中的任何损失。

材料 - 实验室库存

徕卡LMD系统

图1


  • 低温恒温器(如徕卡CM1850 UV)

  • 吸取10-1,000微升

  • 吸取2-20微升

  • 离心管

  • 镊子和刷低温恒温器


材料 - 化学品和消耗品

Qiagen公司的RNeasy微型试剂盒

图2

  • 一袋50毫升猎鹰管

  • 纯乙醇(乙醇),分子生物学级

  • 分子生物学级水

  • 甲酚紫

  • 铝箔

  • 0.50.2毫升薄壁PCR管平驾驶室适合LMD阶段收集架

  • 枪头(1 mL固移液管和20微升吸管)

  • 注射用无菌过滤嘴

  • 刀片cryotome

  • 封口膜

  • 徕卡LMD载玻片(如4微米PEN帧)

  • 硅胶袋

  • Kimwipes


上游的准备

1%甲酚紫(CV)在100%的乙醇(EtOH)溶液:添加5毫克甲酚紫粉到50ml Falcon试管中,加入100%乙醇以填充50毫升 应准备前1周使用。但在猎鹰冰箱,用铝箔覆盖(甲酚紫对光敏感),摇匀每天平缓。奥林巴斯显微镜

用于固定乙醇行洗涤步骤:

  • 2次75%乙醇:填写37.5毫升乙醇到50ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50ml

  • 将一个75%的乙醇猎鹰到-20℃的冰柜

  • 95%乙醇47.5毫升乙醇到50ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50ml

  • 100%的乙醇50毫升EtOH中入50ml Falcon管中

  • 乙醇排在Falcon管可(重新)使用长达3天。

重要提示:

  • 猎鹰印章用封口膜储存→这将避免乙醇蒸发距离!

  • 放置LMD载玻片10分钟下的UV-C光→acivate膜更好部粘附和消毒的表面!

  • 将0.2或0.5 mL管盖下的UV-C光至少开放30分钟→消毒和消除任何RNA核糖核酸酶和!

  • 准备三五十毫升猎鹰管与一些硅胶袋圆锥→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥,RNA工作意味着湿度和水分是你的敌人,因为那些能激活RNA酶!

Cryosectioning

与Cryosample地方块分成徕卡低温恒温器直接从-80℃,并让它平衡至少30分钟,在-19℃。

在图徕卡CM1850紫外线cryotome在-19℃的准备削减3:组织块。


平衡后制成适当厚度的部分(厚度应选择所关注的细胞的根据直径,此测试10μm的切片制备的)。

将一个(卷曲)直接从部分到低温0.5毫升管,立即加入350微升RLT缓冲液(Qiagen公司微RNeasy试剂盒的内容)。 这将作为阳性对照的质量和数量。

 

图4:用冷水镊子收集卷曲部分直接进入无菌管帽。350微升RLT缓冲立即加入到保护RNA降解。


   

图5:部分准备和安装在PEN帧载玻片。将冷冻的部分将容易熔化到它来自室温膜上。


把与部分进猎鹰用75%EtOH溶液的滑动,在-20℃下进行2分钟(简短固定)。2分钟后短暂风干的载玻片,并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋(保持干燥)。

重复此与另一部分和滑动安装,但不是存储通过无菌过滤嘴中添加与所述注射器1%甲酚紫溶液几滴。让关于段1分钟的染色溶液。事后经浸渍滑洗甲酚紫的简要到75%的乙醇,再用95%的乙醇,最后100%的乙醇。 简言之空气干燥的载玻片,并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋(保持干燥)。

与另一部分和载玻片重复整个过程。

 

图6:甲酚紫是通过无菌过滤器覆盖载玻片上的部分为1分钟施加一个注射器。


  

图7:染色后的洗涤步骤:在滑动浸入升乙醇行以洗掉残留甲酚紫。

重要提示:

  • 在猎鹰管与圆锥一些硅胶袋商店载玻片和密封的用封口膜→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥,密封防止水分环境!


存储所有管和猎鹰与冰滑梯。 让载玻片平衡15分钟,在室温下旁LMD系统在密封隼先前使用。


LMD测试滑梯

你现在应该有:

  • 在管1部分与350微升的RLT缓冲液(阳性对照)

  • 1部安装在滑动和固定用EtOH存储在50ml隼与二氧化硅袋

  • 2载玻片安装固定部分与乙醇,并用CV,存储在50毫升猎鹰用硅胶袋

图8:缓冲器,管,载玻片猎鹰和75%的乙醇从在冰上冷冻。


与未染色部分中的滑动被用作另一个控制。 因此,从直接与RLT缓冲膜消化它,并将其转移到0.5毫升管(RLT缓冲总量必须是350微升,消化从载玻片不要使用这一切,因为它会冲洗掉载玻片!)。

一个固定的和染色的载玻片被用作另一个控制。 因此,直接从带RLT缓冲膜消化的部分,并将其转移到0.5毫升管(RLT缓冲的总量必须是350微升,不从滑动使用所有它进行消化,因为它会冲洗掉滑动!) 。


徕卡LMD7000用于RNA分析

剩余的固定和染色的载玻片被应用于LMD。因此加载在样品架滑动并加载0.5毫升管中的收集架。 选择负载的收集器的位置和使用所希望的倍率标记解剖全部与LMD软件。启动所有的部分被收集到收集管解剖后的激光和控制。 在需要的情况下重新切割部分使用移动+切割,以确保所有收集。

卸载收集管,小心盖上盖子,并简要降速dissectates。打开盖子,并添加350微升的RLT缓冲液(高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前)。

 

图9:PEN框架具有固定和染色的切片上被装载到LMD系统。


装入另一收集罩和剖析空膜接近。其中,部分被收集的区域(大致平方微米面积相同的大小)。 卸载收集管,小心盖上盖子,并简要降速dissectates。 打开盖子,并添加350微升的RLT