徕卡显微镜激光显微切割系统和Qiagen公司试剂盒成功分析RNA
激光显微切割（LMD）允许分离单个细胞或染色体，是一个完善的技术通过PCR或测序技术的核酸含量样品制备之前下游分析。在这里，我们描述甚至很少量的徕卡LMD系统和Qiagen公司试剂盒核酸纯化的成功结合。所呈现的工作流程和协议提供成功的LMD应用的基础，而不的核酸量和剩余的RNA的完整性的过程强调产品的高品质中的任何损失。
材料 - 实验室库存
徕卡LMD系统
图1
低温恒温器（如徕卡CM1850 UV）
吸取10-1,000微升
吸取2-20微升
离心管
镊
镊子和刷低温恒温器
材料 - 化学品和消耗品
Qiagen公司的RNeasy微型试剂盒
图2
一袋50毫升猎鹰管
纯乙醇（乙醇），分子生物学级
分子生物学级水
甲酚紫
铝箔
0.50.2毫升薄壁PCR管平驾驶室适合LMD阶段收集架
枪头（1 mL固移液管和20微升吸管）
注射用无菌过滤嘴
冰
刀片cryotome
封口膜
徕卡LMD载玻片（如4微米PEN帧）
硅胶袋
Kimwipes
上游的准备
1％甲酚紫（CV）在100％的乙醇（EtOH）溶液：添加5毫克甲酚紫粉到50ml Falcon试管中，加入100％乙醇以填充50毫升 应准备前1周使用。但在猎鹰冰箱，用铝箔覆盖（甲酚紫对光敏感），摇匀每天平缓。（奥林巴斯显微镜）
用于固定乙醇行洗涤步骤：
2次75％乙醇：填写37.5毫升乙醇到50ml猎鹰管，并添加分子生物学级水至50ml
将一个75％的乙醇猎鹰到-20℃的冰柜
95％乙醇47.5毫升乙醇到50ml猎鹰管，并添加分子生物学级水至50ml
100％的乙醇50毫升EtOH中入50ml Falcon管中
乙醇排在Falcon管可（重新）使用长达3天。
重要提示：
猎鹰印章用封口膜储存→这将避免乙醇蒸发距离！
放置LMD载玻片10分钟下的UV-C光→acivate膜更好部粘附和消毒的表面！
将0.2或0.5 mL管盖下的UV-C光至少开放30分钟→消毒和消除任何RNA核糖核酸酶和！
准备三五十毫升猎鹰管与一些硅胶袋圆锥→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥，RNA工作意味着湿度和水分是你的敌人，因为那些能激活RNA酶！
Cryosectioning
与Cryosample地方块分成徕卡低温恒温器直接从-80℃，并让它平衡至少30分钟，在-19℃。
在图徕卡CM1850紫外线cryotome在-19℃的准备削减3：组织块。
平衡后制成适当厚度的部分（厚度应选择所关注的细胞的根据直径，此测试10μm的切片制备的）。
将一个（卷曲）直接从部分到低温0.5毫升管，立即加入350微升RLT缓冲液（Qiagen公司微RNeasy试剂盒的内容）。 这将作为阳性对照的质量和数量。
图4：用冷水镊子收集卷曲部分直接进入无菌管帽。350微升RLT缓冲立即加入到保护RNA降解。
图5：部分准备和安装在PEN帧载玻片。将冷冻的部分将容易熔化到它来自室温膜上。
把与部分进猎鹰用75％EtOH溶液的滑动，在-20℃下进行2分钟（简短固定）。2分钟后短暂风干的载玻片，并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋（保持干燥）。
重复此与另一部分和滑动安装，但不是存储通过无菌过滤嘴中添加与所述注射器1％甲酚紫溶液几滴。让关于段1分钟的染色溶液。事后经浸渍滑洗甲酚紫的简要到75％的乙醇，再用95％的乙醇，最后100％的乙醇。 简言之空气干燥的载玻片，并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋（保持干燥）。
与另一部分和载玻片重复整个过程。
图6：甲酚紫是通过无菌过滤器覆盖载玻片上的部分为1分钟施加一个注射器。
图7：染色后的洗涤步骤：在滑动浸入升乙醇行以洗掉残留甲酚紫。
重要提示：
在猎鹰管与圆锥一些硅胶袋商店载玻片和密封的用封口膜→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥，密封防止水分环境！
存储所有管和猎鹰与冰滑梯。 让载玻片平衡15分钟，在室温下旁LMD系统在密封隼先前使用。
LMD测试滑梯
你现在应该有：
在管1部分与350微升的RLT缓冲液（阳性对照）
1部安装在滑动和固定用EtOH存储在50ml隼与二氧化硅袋
2载玻片安装固定部分与乙醇，并用CV，存储在50毫升猎鹰用硅胶袋
图8：缓冲器，管，载玻片猎鹰和75％的乙醇从在冰上冷冻。
与未染色部分中的滑动被用作另一个控制。 因此，从直接与RLT缓冲膜消化它，并将其转移到0.5毫升管（RLT缓冲总量必须是350微升，消化从载玻片不要使用这一切，因为它会冲洗掉载玻片！）。
一个固定的和染色的载玻片被用作另一个控制。 因此，直接从带RLT缓冲膜消化的部分，并将其转移到0.5毫升管（RLT缓冲的总量必须是350微升，不从滑动使用所有它进行消化，因为它会冲洗掉滑动！） 。
徕卡LMD7000用于RNA分析
剩余的固定和染色的载玻片被应用于LMD。因此加载在样品架滑动并加载0.5毫升管中的收集架。 选择负载的收集器的位置和使用所希望的倍率标记解剖全部与LMD软件。启动所有的部分被收集到收集管解剖后的激光和控制。 在需要的情况下重新切割部分使用移动+切割，以确保所有收集。
卸载收集管，小心盖上盖子，并简要降速dissectates。打开盖子，并添加350微升的RLT缓冲液（高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前）。
图9：PEN框架具有固定和染色的切片上被装载到LMD系统。
装入另一收集罩和剖析空膜接近。其中，部分被收集的区域（大致平方微米面积相同的大小）。 卸载收集管，小心盖上盖子，并简要降速dissectates。 打开盖子，并添加350微升的RLT缓冲液（高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前）。 该管将作为LMD阴性对照以后。
图10：节解剖一块一块的选择放大倍率到无菌管盖。
图11：标记区和解剖结果很容易显现：左切割线，中部，面积解剖，右dissectate在收集管帽。
重要提示：
多达65微升的RLT缓冲液可直接应用到收集管帽捕获后直接以保护dissectate的内容从降解
图12：用低倍收集Dissectates是用肉眼可看见的（使用5倍的目标实现的例子dissectates的）。
制备及加工下游激光显微切割
添加44毫升瓶子与RPE和检查乙醇添加的复选框。
制备70％EtOH中的溶液中添加35毫升100％乙醇至50ml隼和添加15毫升分子生物学级水。
制备80％EtOH中的溶液中添加40毫升100％乙醇至50ml隼和加入10 mL分子生物学级水。
图13：使用Qiagen公司的RNeasy RNA提取轻微的修改协议®微试剂盒使用。
利用RNA Qiagen公司微套件具有以下略作修改协议的摘录：
都准备好管。
加入350微升70％乙醇，每管（在案件移送到合适音量另一管加入350微升70％乙醇前），仔细拌入吸管，直接转移到红离心柱。
重要提示：
350微升应分别为100和250μl到不超过0.5毫升管的体积。 混合可以直接在柱来完成。
旋转15秒，以10000rpm。
图14：缓冲液被施加到Qiagen公司的RNeasy®旋转柱。
丢弃通过流并添加350微升RW1洗柱
旋转15秒，以10000rpm。
图15：列在离心机蓄势待发。
丢弃通过流量，列放置到新的2ml管中，并加入500μl的RPE（EtOH中加入之前）洗柱
旋转15秒，以10000rpm。
丢弃通过流动，加入500微升80％的乙醇洗柱
旋转2分钟，在13,000rpm下
丢弃流过和列放置到新的2ml管中
旋转5分钟，最大。 速度和盖子打开以干燥塔的二氧化硅膜
洗脱在14微升水：仔细吸管14微升无RNA酶的水送入塔膜的中部和列放置到一个新鲜和标记的1.5mL管中
图16：14微升无RNase水轻轻施加到塔的中部，用于对提取的RNA eluation。
旋转1分钟，在13,000rpm下
仔细吸管流过回柱膜的中间
旋转2分钟，在13,000rpm下
洗脱液应储存在-80℃或如果可能的话立即用于质量和数量的评估。
快速汇总协议
示例：
A - 样品直接从采摘冷冻（整体阳性对照）
β - 样品固定，用吸管挑（阳性对照，乙醇固定作用）
ç - 样品固定染色，用移液管（阳性对照，乙醇固定和染色的效果）挑
ð - 样品固定染色，由LMD（LMD的效果）收集
Ë - 样品采集旁边空膜（阴性对照LMD进程/污染物）
F - RLT缓冲阴性对照下游纯化
RNA与Qiagen公司微提取试剂盒：
加入350微升RLT缓冲
加入350微升70％乙醇，用吸管混合，并直接传输到列
旋转15秒，10000转
丢弃流过，并用350微升RW1
旋转15秒，10000转
丢弃流过，并用500微升RPE（添加乙醇之前）
旋转15秒，10000转
丢弃流过和洗涤用500μl80％的乙醇
旋转2分钟，10000转
丢弃流经
旋转2分钟，最大值 速度盖子打开干燥膜
在洗脱14微升水*
自旋1分钟，全速
使用洗脱液，并把它回柱
自旋1分钟，全速
结果
图17
井 | RIN® | 28S / 18S | 28S / 18S | 浓。 | 样本 | 警报 | 观察 | 总RNA区 | rRNA基因区 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A0 | - | - | - | 137 | 阶梯 | - | - | ||
A1 | 7.4 | 1.4 | 1.9 | 69.1 | 一个 | 2.79 | 0.61 | ||
B1 | 7.1 | 1.3 | 1.9 | 84.5 | B | 3.41 | 0.76 | ||
C1 | 7.3 | 1.4 | 2.0 | 127 | C | 5.13 | 1.26 | ||
D1 | 7.2 | 1.0 | 2.0 | 83.6 | D | 3.38 | 0.78 | ||
E1 | 6.5 | 0.4 | 0.4 | 110 | Ë | 4.44 | 0.98 | ||
D9 | 6.9 | 0.7 | 0.9 | 67.3 | D | 2.68 | 0.59 | ||
C2 | - | - | - | 7.36 | ķ | ！ | RNA浓度外推荐范围为海相 | 0.30 | - |
D2 | - | - | - | 6.57 | L | ！ | RNA浓度外推荐范围为海相 | 0.27 | - |
样品名称 | 材料 | 日期 | 时间 | A260浓度（ng / UL） | A260（10mm）的 | A280（10mm）的 | A260 / A280 | A260 / A230 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
blank_6 | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 0 | 0 | 0 | - | - |
一个 | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 32.42 | 0.81 | 0.41 | 1.98 | 0.13 |
B | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 48.18 | 1.2 | 0.58 | 2.07 | 0.1 |
C | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 71.01 | 1.78 | 0.89 | 2 | 1.51 |
D | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 48.32 | 1.21 | 0.54 | 2.24 | 0.03 |
Ë | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 64.65 | 1.62 | 0.73 | 2.2 | 0.06 |
D | RNA | 2014年12月10日 | ###### | 41.79 | 1.04 | 0.47 | 2.23 | 0.03 |
ķ | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 1.72 | 0.04 | 0.02 | 1.97 | 0.02 |
L | RNA | 2014年12月11日 | ###### | 0.74 | 0.02 | 0.01 | 2.91 | 0.02 |
质量
所有样品（A-D）具有不同的治疗具有几乎相同的质量（RIN 7.1-7.4）。 无影响乙醇固定，染色和徕卡LMD解剖检测。
低温储存滑动的一个封口膜密封50毫升Falcon管中在-80℃下过夜，在室温下轻轻地解冻分步进行20分钟在-20℃冷冻，20分钟在4℃冰箱和15分钟之前重新打开猎鹰管导致徕卡LMD解剖后类似的结果，以及（样品E1及D9，RIN 6.9和6.5）。
所有阴性对照空。
数量
所有样品（A-D）与不同的治疗方法几乎相同的量，只有样品C（固定，染色，直接拿起从载玻片）显示出较高的数量，然后阳性对照（样品A）。不影响从乙醇固定，染色或徕卡LMD解剖检测。
低温储存滑动的一个封口膜密封50毫升Falcon管中，在-80℃下过夜，在现有室温轻轻解冻分步进行20分钟在-20℃冷冻，20分钟在4℃冰箱和15分钟重新打开猎鹰管导致徕卡LMD解剖后类似的结果，以及（样品E1和D9，储存后略高的数量）。
所有阴性对照空。
测量方法不同导致的测量误差共同不同的结果。
总之，这些数据清楚地表明，在工作流不影响RNA的质量和数量。
确认
我想感谢博士伦道夫Habecker主办的LMD车间。
沪ICP备11031664号
