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徕卡显微镜激光显微切割系统和Qiagen公司试剂盒成功分析RNA

2015-07-13  发布者:admin 

激光显微切割(LMD)允许分离单个细胞或染色体,是一个完善的技术通过PCR或测序技术的核酸含量样品制备之前下游分析。在这里,我们描述甚至很少量的徕卡LMD系统和Qiagen公司试剂盒核酸纯化的成功结合。所呈现的工作流程和协议提供成功的LMD应用的基础,而不的核酸量和剩余的RNA的完整性的过程强调产品的高品质中的任何损失。

材料 - 实验室库存

徕卡LMD系统

图1


  • 低温恒温器(如徕卡CM1850 UV)

  • 吸取10-1,000微升

  • 吸取2-20微升

  • 离心管

  • 镊子和刷低温恒温器


材料 - 化学品和消耗品

Qiagen公司的RNeasy微型试剂盒

图2

  • 一袋50毫升猎鹰管

  • 纯乙醇(乙醇),分子生物学级

  • 分子生物学级水

  • 甲酚紫

  • 铝箔

  • 0.50.2毫升薄壁PCR管平驾驶室适合LMD阶段收集架

  • 枪头(1 mL固移液管和20微升吸管)

  • 注射用无菌过滤嘴

  • 刀片cryotome

  • 封口膜

  • 徕卡LMD载玻片(如4微米PEN帧)

  • 硅胶袋

  • Kimwipes


上游的准备

1%甲酚紫(CV)在100%的乙醇(EtOH)溶液:添加5毫克甲酚紫粉到50ml Falcon试管中,加入100%乙醇以填充50毫升 应准备前1周使用。但在猎鹰冰箱,用铝箔覆盖(甲酚紫对光敏感),摇匀每天平缓。奥林巴斯显微镜

用于固定乙醇行洗涤步骤:

  • 2次75%乙醇:填写37.5毫升乙醇到50ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50ml

  • 将一个75%的乙醇猎鹰到-20℃的冰柜

  • 95%乙醇47.5毫升乙醇到50ml猎鹰管,并添加分子生物学级水至50ml

  • 100%的乙醇50毫升EtOH中入50ml Falcon管中

  • 乙醇排在Falcon管可(重新)使用长达3天。

重要提示:

  • 猎鹰印章用封口膜储存→这将避免乙醇蒸发距离!

  • 放置LMD载玻片10分钟下的UV-C光→acivate膜更好部粘附和消毒的表面!

  • 将0.2或0.5 mL管盖下的UV-C光至少开放30分钟→消毒和消除任何RNA核糖核酸酶和!

  • 准备三五十毫升猎鹰管与一些硅胶袋圆锥→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥,RNA工作意味着湿度和水分是你的敌人,因为那些能激活RNA酶!

Cryosectioning

与Cryosample地方块分成徕卡低温恒温器直接从-80℃,并让它平衡至少30分钟,在-19℃。

在图徕卡CM1850紫外线cryotome在-19℃的准备削减3:组织块。


平衡后制成适当厚度的部分(厚度应选择所关注的细胞的根据直径,此测试10μm的切片制备的)。

将一个(卷曲)直接从部分到低温0.5毫升管,立即加入350微升RLT缓冲液(Qiagen公司微RNeasy试剂盒的内容)。 这将作为阳性对照的质量和数量。

 

图4:用冷水镊子收集卷曲部分直接进入无菌管帽。350微升RLT缓冲立即加入到保护RNA降解。


   

图5:部分准备和安装在PEN帧载玻片。将冷冻的部分将容易熔化到它来自室温膜上。


把与部分进猎鹰用75%EtOH溶液的滑动,在-20℃下进行2分钟(简短固定)。2分钟后短暂风干的载玻片,并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋(保持干燥)。

重复此与另一部分和滑动安装,但不是存储通过无菌过滤嘴中添加与所述注射器1%甲酚紫溶液几滴。让关于段1分钟的染色溶液。事后经浸渍滑洗甲酚紫的简要到75%的乙醇,再用95%的乙醇,最后100%的乙醇。 简言之空气干燥的载玻片,并将其存储在50毫升猎鹰与圆锥一些硅胶袋(保持干燥)。

与另一部分和载玻片重复整个过程。

 

图6:甲酚紫是通过无菌过滤器覆盖载玻片上的部分为1分钟施加一个注射器。


  

图7:染色后的洗涤步骤:在滑动浸入升乙醇行以洗掉残留甲酚紫。

重要提示:

  • 在猎鹰管与圆锥一些硅胶袋商店载玻片和密封的用封口膜→二氧化硅将保持载玻片和部分干燥,密封防止水分环境!


存储所有管和猎鹰与冰滑梯。 让载玻片平衡15分钟,在室温下旁LMD系统在密封隼先前使用。


LMD测试滑梯

你现在应该有:

  • 在管1部分与350微升的RLT缓冲液(阳性对照)

  • 1部安装在滑动和固定用EtOH存储在50ml隼与二氧化硅袋

  • 2载玻片安装固定部分与乙醇,并用CV,存储在50毫升猎鹰用硅胶袋

图8:缓冲器,管,载玻片猎鹰和75%的乙醇从在冰上冷冻。


与未染色部分中的滑动被用作另一个控制。 因此,从直接与RLT缓冲膜消化它,并将其转移到0.5毫升管(RLT缓冲总量必须是350微升,消化从载玻片不要使用这一切,因为它会冲洗掉载玻片!)。

一个固定的和染色的载玻片被用作另一个控制。 因此,直接从带RLT缓冲膜消化的部分,并将其转移到0.5毫升管(RLT缓冲的总量必须是350微升,不从滑动使用所有它进行消化,因为它会冲洗掉滑动!) 。


徕卡LMD7000用于RNA分析

剩余的固定和染色的载玻片被应用于LMD。因此加载在样品架滑动并加载0.5毫升管中的收集架。 选择负载的收集器的位置和使用所希望的倍率标记解剖全部与LMD软件。启动所有的部分被收集到收集管解剖后的激光和控制。 在需要的情况下重新切割部分使用移动+切割,以确保所有收集。

卸载收集管,小心盖上盖子,并简要降速dissectates。打开盖子,并添加350微升的RLT缓冲液(高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前)。

 

图9:PEN框架具有固定和染色的切片上被装载到LMD系统。


装入另一收集罩和剖析空膜接近。其中,部分被收集的区域(大致平方微米面积相同的大小)。 卸载收集管,小心盖上盖子,并简要降速dissectates。 打开盖子,并添加350微升的RLT缓冲液(高达65微升的RLT缓冲液可以添加到集合帽切割前)。 该管将作为LMD阴性对照以后。

图10:节解剖一块一块的选择放大倍率到无菌管盖。


  

图11:标记区和解剖结果很容易显现:左切割线,中部,面积解剖,右dissectate在收集管帽。

重要提示:

  • 多达65微升的RLT缓冲液可直接应用到收集管帽捕获后直接以保护dissectate的内容从降解

图12:用低倍收集Dissectates是用肉眼可看见的(使用5倍的目标实现的例子dissectates的)。


制备及加工下游激光显微切割

  • 添加44毫升瓶子与RPE和检查乙醇添加的复选框。

  • 制备70%EtOH中的溶液中添加35毫升100%乙醇至50ml隼和添加15毫升分子生物学级水。

  • 制备80%EtOH中的溶液中添加40毫升100%乙醇至50ml隼和加入10 mL分子生物学级水。

图13:使用Qiagen公司的RNeasy RNA提取轻微的修改协议®微试剂盒使用。


利用RNA Qiagen公司微套件具有以下略作修改协议的摘录:

  1. 都准备好管。

  1. 加入350微升70%乙醇,每管(在案件移送到合适音量另一管加入350微升70%乙醇前),仔细拌入吸管,直接转移到红离心柱。

重要提示:

350微升应分别为100和250μl到不超过0.5毫升管的体积。 混合可以直接在柱来完成。

  1. 旋转15秒,以10000rpm。

图14:缓冲液被施加到Qiagen公司的RNeasy®旋转柱。


  1. 丢弃通过流并添加350微升RW1洗柱

  2. 旋转15秒,以10000rpm。

图15:列在离心机蓄势待发。


  1. 丢弃通过流量,列放置到新的2ml管中,并加入500μl的RPE(EtOH中加入之前)洗柱

  2. 旋转15秒,以10000rpm。

  3. 丢弃通过流动,加入500微升80%的乙醇洗柱

  4. 旋转2分钟,在13,000rpm下

  5. 丢弃流过和列放置到新的2ml管中

  6. 旋转5分钟,最大。 速度和盖子打开以干燥塔的二氧化硅膜

  7. 洗脱在14微升水:仔细吸管14微升无RNA酶的水送入塔膜的中部和列放置到一个新鲜和标记的1.5mL管中

图16:14微升无RNase水轻轻施加到塔的中部,用于对提取的RNA eluation。


  1. 旋转1分钟,在13,000rpm下

  2. 仔细吸管流过回柱膜的中间

  3. 旋转2分钟,在13,000rpm下

洗脱液应储存在-80℃或如果可能的话立即用于质量和数量的评估。


快速汇总协议

示例:

A - 样品直接从采摘冷冻(整体阳性对照) 
β - 样品固定,用吸管挑(阳性对照,乙醇固定作用) 
ç - 样品固定染色,用移液管(阳性对照,乙醇固定和染色的效果)挑 
ð - 样品固定染色,由LMD(LMD的效果)收集 
Ë - 样品采集旁边空膜(阴性对照LMD进程/污染物) 
F - RLT缓冲阴性对照下游纯化 

RNA与Qiagen公司微提取试剂盒:

  1. 加入350微升RLT缓冲

  2. 加入350微升70%乙醇,用吸管混合,并直接传输到列

  3. 旋转15秒,10000转

  4. 丢弃流过,并用350微升RW1

  5. 旋转15秒,10000转

  6. 丢弃流过,并用500微升RPE(添加乙醇之前)

  7. 旋转15秒,10000转

  8. 丢弃流过和洗涤用500μl80%的乙醇

  9. 旋转2分钟,10000转

  10. 丢弃流经

  11. 旋转2分钟,最大值 速度盖子打开干燥膜

  12. 在洗脱14微升水*

  13. 自旋1分钟,全速

  14. 使用洗脱液,并把它回柱

  15. 自旋1分钟,全速

结果

图17


RIN®

28S / 18S 
(高度)

28S / 18S 
(区)

浓。 
(纳克/微升)

样本 
描述

警报

观察

总RNA区

rRNA基因区

A0

-

-

-

137



阶梯

-

-

A1

7.4

1.4

1.9

69.1

一个



2.79

0.61

B1

7.1

1.3

1.9

84.5

B



3.41

0.76

C1

7.3

1.4

2.0

127

C



5.13

1.26

D1

7.2

1.0

2.0

83.6

D



3.38

0.78

E1

6.5

0.4

0.4

110

Ë



4.44

0.98

D9

6.9

0.7

0.9

67.3

D



2.68

0.59

C2

-

-

-

7.36

ķ

RNA浓度外推荐范围为海相

0.30

-

D2

-

-

-

6.57

L

RNA浓度外推荐范围为海相

0.27

-

样品名称

材料

日期

时间

A260浓度(ng / UL)

A260(10mm)的

A280(10mm)的

A260 / A280

A260 / A230

blank_6

RNA

2014年12月11日

######

0

0

0

-

-

一个

RNA

2014年12月11日

######

32.42

0.81

0.41

1.98

0.13

B

RNA

2014年12月11日

######

48.18

1.2

0.58

2.07

0.1

C

RNA

2014年12月11日

######

71.01

1.78

0.89

2

1.51

D

RNA

2014年12月11日

######

48.32

1.21

0.54

2.24

0.03

Ë

RNA

2014年12月11日

######

64.65

1.62

0.73

2.2

0.06

D

RNA

2014年12月10日

######

41.79

1.04

0.47

2.23

0.03

ķ

RNA

2014年12月11日

######

1.72

0.04

0.02

1.97

0.02

L

RNA

2014年12月11日

######

0.74

0.02

0.01

2.91

0.02


质量

所有样品(A-D)具有不同的治疗具有几乎相同的质量(RIN 7.1-7.4)。 无影响乙醇固定,染色和徕卡LMD解剖检测。

低温储存滑动的一个封口膜密封50毫升Falcon管中在-80℃下过夜,在室温下轻轻地解冻分步进行20分钟在-20℃冷冻,20分钟在4℃冰箱和15分钟之前重新打开猎鹰管导致徕卡LMD解剖后类似的结果,以及(样品E1及D9,RIN 6.9和6.5)。

所有阴性对照空。


数量

所有样品(A-D)与不同的治疗方法几乎相同的量,只有样品C(固定,染色,直接拿起从载玻片)显示出较高的数量,然后阳性对照(样品A)。不影响从乙醇固定,染色或徕卡LMD解剖检测。

低温储存滑动的一个封口膜密封50毫升Falcon管中,在-80℃下过夜,在现有室温轻轻解冻分步进行20分钟在-20℃冷冻,20分钟在4℃冰箱和15分钟重新打开猎鹰管导致徕卡LMD解剖后类似的结果,以及(样品E1和D9,储存后略高的数量)。

所有阴性对照空。

测量方法不同导致的测量误差共同不同的结果。


总之,这些数据清楚地表明,在工作流不影响RNA的质量和数量。


确认

我想感谢博士伦道夫Habecker主办的LMD车间。