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奥林巴斯显微镜的荧光共振能量转移(FRET)

2015-06-26  发布者:admin 

初级概念

特定分子种类之间的相互作用的活细胞中的精确位置和性质是在生物学研究的许多领域主要关心的,但是调查经常被用来研究这些现象的文书的分辨率有限的阻碍。 常规宽视场荧光显微镜使在由瑞利判据,约200纳米(0.2微米)所定义的光空间分辨率极限本地化荧光标记的分子。 然而,为了理解所涉及的典型的生物分子的过程蛋白伙伴之间的物理相互作用,分子的相对接近度,必须更精确地确定比衍射限制的传统的光学成像方法许可证。 荧光共振能量转移的技术中,当施加到光学显微镜(更常用的缩写为FRET简称),允许确定几个纳米内的两个分子之间的做法(见图1),一个距离充分接近用于分子间的相互作用,以发生。

典型的荧光显微镜技术依赖于吸收由光的荧光团在一个波长(激发),其次是次级荧光的波长更长的后续发射。 激发和发射波长通常彼此分离,以几十到几百纳米。 细胞组分,如细胞核,线粒体,细胞骨架,高尔基体,和膜,以特定荧光团的标记使固定和活制剂内的定位。 通过同时标记几个亚细胞结构与具有分开的激发和发射光谱个别荧光团,专门荧光滤波器的组合可以被用来检查标记的分子在一个单一的细胞或组织切片的接近。 利用这种技术,分子更靠近在一起比光学分辨率极限看来是一致的,这明显的空间接近性,表明一个分子缔合是可能的。 在大多数情况下,但是,正常衍射限制荧光显微镜的分辨率是不够的,以确定生物分子之间的相互作用是否实际发生。 荧光共振能量转移是由从激发态的荧光团的能量的非辐射转移发生在靠近的第二发色团的方法。 因为在其上的能量传递可以发生限制在大约10纳米(100埃),而转移的效率的范围是荧光团之间的间隔距离极为敏感,共振能量转移测量可用于探测分子相互作用的有价值的工具。

荧光共振能量转移的机制涉及的供体荧光团在一个激发电子态,其可以在一个非辐射方式通过远程偶极-偶极相互作用的激发能量转移到附近的受体发色团。 理论支撑能量转移是基于一种治疗激发的荧光团作为振荡偶极子,可以经受与具有相似的谐振频率的第二偶极的能量交换的概念。 在这方面,共振能量转移类似于耦合振子,例如一对音叉振动在同一频率的的行为。 与此相反,辐射能量转移,需要发射的光子的和再吸收,并且依赖于物理尺寸和样品的光学性质,以及该容器的几何形状和波前通路。 不像辐射机理,共振能量转移可产生显著量有关的供体 - 受体对的结构信息。

共振能量转移不是荧光团的周围溶剂壳敏感,因此,会产生特有的,通过溶剂依赖性的事件,如荧光猝灭,激发态反应,溶剂松弛,或各向异性测量表明分子信息。 于参与共振能量转移荧光基团的主要溶剂的影响是在供体和受体的光谱特性的影响。 发生非辐射能量转移过更长的距离比短程溶剂效应,以及成分的介电性质(溶剂和宿主大分子)位于所涉及的荧光团之间对共振能量转移的功效,这主要取决于非常影响不大供体和受体荧光团之间的距离。

荧光共振能量转移的现象不是由光子发射介导,而且,甚至不要求受体发色团是荧光的。 在大多数应用中,然而,无论是供体和受体是荧光,和能量转移的发生本身表现通过供体荧光和减少的荧光寿命的淬火,也伴随着增加受体的荧光发射。 能量转移过程的效率成比例地分离供体和受体分子的距离的倒数第六功率变化。因此,FRET测量可以用作一个有效的分子尺 ,用于确定生物分子标记与合适的供体和受体荧光染料时,他们中的10纳米彼此之间的距离。

连接到相同的大分子蛋白质的相对端的两个荧光染料之间的荧光共振能量转移的一个假设的例子示于图1中的天然构象(图1(a)),这两个荧光团是由约12纳米的距离隔开,太多的荧光染料之间的分子内能量转移发生。 但是,当蛋白质被诱导经历构象变化(图1(b)),这两个荧光染料被带到更接近在一起,现在可以参与的FRET的分子相互作用。 在该图中,供体荧光的激励是通过围绕黄色三核的芳族分子蓝色辉光表示,而相应的受体发射(图1(b))由围绕在右侧的第二杂环荧光绿色辉光表示蛋白质 - 手侧。 能量转移测量常常用来估计对大分子站点和对这些距离的构象变化的影响之间的距离。 在这种类型的实验,能量转移的程度被用于计算供体和受体之间的距离,并获取有关大分子的结构信息。奥林巴斯显微镜

虽然荧光共振能量转移经常被用于研究在蛋白质和脂类分子内和分子结构和功能上的修改,在活细胞中的一个主要障碍实施FRET显微技术一直缺乏合适的方法用于标记特定细胞内蛋白质与合适的荧光团。 水母绿色荧光蛋白(GFP)及其在多种细胞类型中表达的克隆已经成为一个重要的关键显影标记两者的基因表达和结构蛋白定位在活细胞中。 该蛋白质的几个光谱不同的突变的变体已经被开发,包括发射蓝光( 蓝色荧光蛋白,BFP)的荧光蛋白质。 既激发和用于母体GFP发射光谱和BFP的突变体充分分开在波长为与FRET方法兼容。 图2示出的策略检测使用荧光共振能量转移和突变荧光蛋白质的蛋白质 - 蛋白质相互作用。 如果两种蛋白质,一种标记用BFP(供体)和其它用GFP(受体),物理交互,然后在受体发射最大值(510纳米)时,配合物是激发在最大吸收波长将观察到强度增加(380纳米)的供体。 蛋白质的未形成复合物的结果中没有受体(GFP)的荧光发射。

加上在脉冲激光器,显微镜光学,和基于计算机的成像技术的进步,贴标签技术的发展,其中,供体和受体荧光团实际上本身已启用了动态蛋白质相互作用的可视化的活细胞内的生物分子的一部分。 除了蛋白质配偶体相互作用的调查,最近荧光共振能量转移的应用包括蛋白酶活性的研究中,在膜电压电位,钙代谢的改变,以及高通量筛选测定法的传导,例如用于基因表达的定量单个活细胞。

荧光共振能量转移原理

共振能量转移(RET)的过程可以发生在处于电子激发态的供体荧光团转让其激发能量向附近的一个发色团,该受体。 原则上,如果供体分子的荧光发射光谱重叠的受体分子的吸收光谱,和两者的最小空间半径内,供体可以直接其激发能量通过长范围偶极 - 偶极分子间转移至受体耦合。 在20世纪40年代末提出的西奥多·福斯特一个理论最初描述参与共振能量转移的分子间的相互作用,而福斯特也制定了正式的方程式定义的传输速率,发色团距离,所涉及的发色团的光谱特性之间的关系。

共振能量转移是一个非辐射的量子力学的过程,不需要碰撞,并且不涉及生产热。 当能量转移发生时,受体分子猝灭供体分子荧光,并且如果受体本身是荧光染料,增加或敏化荧光发射被观察(参照图3)。 这种现象可以通过激励包含供体和受体分子的光对应于最大吸收供体荧光团的波长的试样进行观察,并在波长为中心的附近的发射最大值的受体的检测发出的光。 另一种检测方法,在普及迅速增长,是测量受体的存在和不存在供体荧光团的荧光寿命。

示于图3是雅布隆斯基示出的供体发射和受体吸光度在荧光共振能量转移之间所涉及的耦合转换。 吸收和发射的转换是由直的垂直箭头(绿色和红色,分别)表示,而振动弛豫由黄色波浪箭头指示。 耦合过渡绘制与建议其正确位置在图雅布隆斯基他们应该已经出现,从光子介导的电子跃迁虚线。 在合适的接受体的存在下,供体荧光团能够在不发射的光子(图3中由一个蓝色箭头示出)直接传递激发态能量给受体。 所得敏荧光发射具有与所述受体的发射光谱特性。

几个标准必须被满足,以便共振能量转移发生。 除了供体和受体分子的重叠的发射和吸收光谱,两个所涉及的荧光团必须定位的范围内互相为1〜10纳米范围内。 如由福斯特来自方程描述(和下面讨论),供体和受体分子之间的能量转移效率随着分离两个距离的第六功率。 因此,供体荧光团的由非辐射相互作用其激发能转移到受体的能力与分子之间的距离的增加,限制了FRET现象到大约10纳米的最大供体 - 受体分离半径急剧减小。 在距离小于1纳米,能量和/或电子转移的几个其它模式是可能的。 共振能量转移过程的距离的依赖性是为其在分子间的相互作用的调查工具的主要基础。 在活涉及分子标记与供体和受体荧光团细胞的研究中,共振能量转移会发生仅分子足够接近彼此生物相互作用之间。

用于共振能量转移的附加要求是,供体分子的荧光寿命必须具有足够的持续时间,以允许所述事件的发生。两个速率(K(T))和能量传递的效率(E(T))直接相关的受体的存在和不存在下的供体荧光团的寿命。根据福斯特的理论,和实验验证,能量转移的速率由下式给出:

KT = (1/τD) • [R0/r]6

其中R(0)福斯特临界距离,τ(D)是在不存在受体的供体寿命,r是分离的供体和受体生色团之间的距离。 的福斯特临界距离(R(0))被定义为受体-供体分离半径的量,传送速率等于施主衰变(去激励)在没有受体的速率。 换句话说,当供体和受体半径(r)等于福斯特距离,然后转移效率为50%左右。 在这种分离半径,一半的施主激发能量被转移到通过共振能量转移的受体,而另一半是通过所有其他可用的方法,包括荧光发射的组合消散。

从概念上讲,福斯特临界距离是供体和受体分子在其下仍然会发生共振能量转移之间的最大间隔长度。 临界距离值通常落入范围为2至6纳米,这是偶然许多蛋白质分子尺寸的数量级之内。 此外,该临界距离范围也对应于几个其它生物显著尺寸,如细胞膜的厚度和分离上具有多个亚基蛋白位点的距离。 R的值(0)(以纳米)可从以下表达式计算:

R0 = 2.11 × 10-2 • [κ2 • J(λ) • η-4 • QD]1/6

其中κ-squared是描述供体和受体的过渡偶极子之间在空间中的相对方位的一个因素,J(λ)为重叠积分中的供体发射和受体的吸收光谱的区域(与波长用纳米表示),η表示介质的折射率,且Q(D)是供体的量子产率。

能量转移,E(T)的效率,是光子通过被转移到受主的施主吸收的分数的量度,并且是相关的供体-受体的分离距离 r,通过公式:

r = R0 • [(1/ET) - 1]1/6

E(T)被评价为:

ET = 1 - (τDAD)

其中τ(DA)是在受体和τ(D)的存在下,供体寿命是在不存在受体的供体寿命。 因此,通过测定在受体的存在和不存在施主荧光寿命(其表示施主淬火的程度,由于受主),有可能确定分离供体和受体分子的距离。 在许多常用的技术中,能量传递效率是由受体的存在和不存在下的相对平均施主荧光强度的稳态测量确定(不通过测定生存期)。

总之,能量转移的速率取决于供体发射和受体的吸收光谱之间的光谱重叠的程度(参见图4),供体的量子产率,供体和受体跃迁偶极矩的相对取向,并距离分离的供体和受体分子。 任何事件或过程,影响供体和受体之间的距离将影响共振能量转移速率,因此使得现象进行量化,只要工件可被控制或消除。

呈现在图4中为青色荧光蛋白(CFP,供体)和红色荧光蛋白(RFP红色荧光蛋白 ,受体)时比较它们的潜在应用为荧光共振能量转移对的吸收和发射光谱。 这两个生物肽吸收光谱被示出为红色的曲线,而发射光谱表示为蓝色曲线。 供体发射和受体的吸收光谱之间的重叠区域是由曲线的底部附近的灰色区域表示。 每当分子的光谱重叠增加太远,从激发受体哪些信号(产生于供体的激发光照)和供体发射在受体发射信道检测这种现象称为频谱出血或交叉出现。 其结果是,必须从弱受体荧光发射被提取高背景信号。

非辐射能量传递的基本理论是直接适用于一个供体-受体对由固定距离分开,在这种情况下,能量转移的速率是福斯特距离的函数,R(0),而这又取决于κ-squared J(λ),η,Q(D)中 。 如果这些因素是已知的,供体和受体之间的距离可以被计算出来。 更复杂的制剂是必需的来描述,如多受体生色团和距离的分布的情况。 示于表1中的一系列实验测量福斯特临界距离,这是从几个流行供体 - 受体荧光团对的光谱重叠确定。 因为变量包括施主quantium收率和光谱重叠的程度,这两者都取决于局部环境条件,福斯特距离值应相同的实验条件下的那些来探讨共振能量转移下来确定。

能量传递介质的折射率,通常从溶剂组合物已知的,或可估计为一个特定的大分子,并且通常取为在水溶液中1.4。 供体的量子产率是通过比较与已知的量子产率标准确定的荧光。 由于Q(D)出现第六根R的计算(0),Q(D)的值小错误或不确定性不会对福斯特距离计算有很大的影响。 还由于第六根依赖性,R(0)未很大程度上受以J的变化(λ),但重叠积分仍然必须为每个供体-受体对评价。 在一般情况下,更高程度的供体发射光谱和受体的吸收光谱之间的重叠产生较大福斯特临界距离值。

对于福斯特临界距离 

常见的RET供体-受体对
DonorAcceptorFörster Distance
(Nanometers)
TryptophanDansyl2.1
IAEDANS (1)DDPM (2)2.5 - 2.9
BFPDsRFP3.1 - 3.3
DansylFITC3.3 - 4.1
DansylOctadecylrhodamine4.3
CFPGFP4.7 - 4.9
CF (3)Texas Red5.1
FluoresceinTetramethylrhodamine4.9 - 5.5
Cy3Cy5>5.0
GFPYFP5.5 - 5.7
BODIPY FL (4)BODIPY FL (4)5.7
Rhodamine 6GMalachite Green6.1
FITCEosin Thiosemicarbazide6.1 - 6.4
B-PhycoerythrinCy57.2
Cy5Cy5.5>8.0
表1

(1)5-(2- iodoacetylaminoethyl)氨基萘-1-磺酸 
(2)N-(4-二甲基氨基- 3,5-二硝基苯基)马来酰亚胺 
(3)羧基琥珀酰亚胺酯 
(4)4,4-二氟-4-硼杂3α,4α二氮杂-s-苯并二茚

在评价取向系数的不确定性(κ-squared)已在文献中广泛讨论,尽管实验证据表明,福斯特理论是有效的,并适用于距离测量,该变量继续是有些争议。 要认识到福斯特距离为κ-squared,2/3(0.67)典型的动态平均值的假定值通常给它是重要的。 这假定从供体和受体的方向随机值结果进行旋转扩散之前,能量转移。 取向因子取决于在供体发射偶极子和受体吸收偶极的空间相对取向,并且范围可以从零到4的值1对应于平行过渡偶极子,而4个结果值从偶极子都平行线的和。

因为第六根关系到福斯特距离,在取向因子为1至4的变型只产生在所计算出的距离的26%的变化,和35%的最大误差是可能的,当为0.67的习惯假定值是应用。 如果偶极恰好彼此垂直和相应的κ-squared值取向的最严重的潜在的错误结果变为等于零。 几种技术处理的不确定性已经采用,包括一系列的静态取向存在和荧光团的激发态寿命期间不改变的假设。 荧光各向异性的供体和受体的测量可以允许为κ-squared变化来确定极限。 此外,利用具有低荧光偏振(由于从几个重叠跃迁发射)的荧光团的减少在取向因子的不确定性。 κ-squared以这种方式的可能值的限制减少了潜在的距离计算误差到大约10%左右。

在许多情况下,取向的因素是困难的,如果不是不可能的,以确定与该变量的精确值往往被视为一个难以克服的问题。 然而,一些证据表明该因子在共振能量转移计算的重要性的限制。 利用共振能量转移光谱和X射线衍射技术供体和受体的距离比较很大程度上支持假设的0.67的值的系数(所建议的福斯特理论),至少对于小肽和蛋白质的有效性。 更多的不确定性存在较大的蛋白质。 使用这种价值取向的因素是,这两个供体和受体的探针可以自由地进行无限制的各向同性运动的假设下有效。 进一步的理由是从实验证据获得,对于附接由一个单键或双键与大分子的荧光团,供体和受体的节段性运动倾向于导致动态随机取向。

为松散结合的荧光染料,围绕单键自由旋转运动应使用的平均取向值的,但分子通过多个连杆站点约束的自由运动可能不会发生。 另一方面,零和极值-squared所需要的供体和受体,这种情况是不可能达到的完整荧光偏振。 统计计算已经提出了一些调查人员认为供体 - 受体分布距离和方向的确定所观察到的平均距离。条件是在观察到的距离的一些分布(这不是由供体和受体过于靠近相对于R(0)的限制),可以确实地得到荧光团之间的平均距离和不确定性,由于评估取向系数。

取向因子对供体发射偶极和受体吸收偶极(图5中示出)的相对取向的依赖性(κ-squared)是由下式给出:

κ2 = (cos θT - 3cos θDcos θA)2
= (sin θD sin θAcos Φ - 2cos θDcos θA)2

其中,θ(t)是供体的发射跃迁偶极和受体的吸收跃迁偶极,θ(D)θ(A)之间的角度是这些偶极子和载体接合供体和受体之间的角度,并Φ是含有两个过渡偶极子平面之间的角度。

能量传递效率是最敏感的距离变化时,供体-受体的分离长度接近福斯特距离(R(0))的两个分子。 图6示出了转印效率和分离的供体和受体之间的距离的指数关系。 效率急剧增加到100%,因为分离距离减小到低于R(0),反之,减小到零,当r大于R(0)。 由于距离上的转移效率强(第六功率)的依赖,给体 - 受体分离距离测量是唯一可靠的当供体和受体半径的二分之一在于福斯特距离之内。 r是约50%的R(0),共振能量转移效率为接近最大和距离较短,不能可靠地确定。 当供体-受体距离的50%超过了R(0)值,曲线的斜率是太浅,更长的间隔距离都没有解决。

知道临界福斯特距离的实际意义在于,值提供到可以由FRET对于给定的一对探针来确定分隔距离的范围内的导向器(见表1)。 因为能量转移测量到的距离的变化非常敏感,当供体 - 受体距离是靠近福斯特距离,所述目标分子相互作用的大致尺寸是在选择的荧光染料对最重要的因素。 应该考虑的,取决于是否稳态或时间分辨测量也在进行中的其他因素,包括化学稳定性,量子产率,以及荧光团衰变寿命。 因为没有内部距离参考存在对于常见荧光共振能量转移技术,走距离计算通过测量转移效率是相对于福斯特距离,这是从在供体 - 受体对测量光谱数据导出。

由福斯特机制共振能量转移的现象是在其产生的效果在一些方面复杂的,但简单和可靠。 福斯特距离是从供体和受体的光谱特性准确预测的,并且由于没有例外的理论尚未被确定,共振能量转移可以假设将施主 - 受主分子对紧邻任何条件下进行。 在该理论描述偶极转移产生的复杂性转移机制本身,不是因为,但由于距离分布(包括非随机分布),以及供体和受体分子的扩散发生。 当以平均距离在一定范围内的几何形状和时限的能量转移的依赖正在采取措施,FRET是一种可靠的技术相互作用的分子间的空间分布研究。

FRET技术在光学显微镜的应用

显微镜构参数为荧光共振能量转移的调查与荧光团,标本和成像模式(多个)的要求而改变,但几乎所有的直立或倒置显微镜可以改装为FRET显微镜(见图7)。 在一般情况下,在显微镜应该装有一个高分辨率(12位)中的冷却和加强耦合到具有串扰对应密切的荧光团的光谱低水平(最小闭锁电平)和带通区域质量干涉滤光器的CCD摄像系统。 探测器的灵敏度决定了带通滤波器如何缩小可同时也使数据采集继续以可接受的速度以最小的光谱出血通噪音。 在大多数情况下,一个单一的二色镜耦合到激发和发射滤光轮或滑应使用,以尽量减少或消除图象偏移获取图像。

从荧光团发射始发上方和下方的焦平面宽视场荧光显微镜患有与显著外的聚焦信号,降低对比度,并导致图像劣化产生的图像。 因为产生作为能量共振转移的结果,固有的低信号电平的这个问题更加复杂的FRET显微镜。 数字去卷积技术可耦合到光学切片,以减少或消除信号远离焦平面,但过程是计算密集型的,可能不足够快许多动态FRET成像实验。 激光扫描共聚焦技术可以应用到FRET显微镜以产生横向分辨率一个显著改善,同时使串行光学切片的收集间隔接近实时。 共焦显微镜的主要缺点是激发波长到可用于特定系统,它限制了荧光团供体和受体对在共振能量转移实验的选择标准的激光线的限制。 多光子激发也可以采用结合FRET技术和较少损害由于所涉及的较长的激发波长的细胞。 另外,自体荧光的工件和试样的光漂白的可能性较小多光子激发的限制激发体积特性内发生。

能够观察活细胞中培养几个荧光共振能量转移成像图案的一个典型的显微镜结构示于图7中倒组织培养显微镜配备在柱子上的一个标准的卤钨灯灯箱以检查并记录细胞使用标准的明场,相衬,或微分干涉对比(DIC)的照明。 需要注意的是后两种对比增强技术可以组合使用与荧光以显示细胞结构内的荧光团的空间位置。 一个标准的珀耳帖冷却的CCD照相机系统附连到显微镜三目为宽视场荧光和明视场图像捕获。

共振能量转移实验使用任一广角照明(电弧放电灯)或实时扫描共焦附件配备有高速尼普科夫盘系统在图7所示的多光谱显微镜进行。 氩氪激光束通过一个声光可调谐波长设备第一滤波传递到共焦扫描头之前,选择特定的激发波长。 图像采集采用两个高分辨率第三代强化的冷却CCD相机读独立通道,并缠绕到主机。 扫描样品在横向(x和y)和轴向(z)的平面能够收集的光学切片的三维图像重建。 多种图像处理软件程序的说明显微镜配置兼容。

基于这种现象的根本原则,一些重要的实际点时,应考虑荧光共振能量转移测量用光学显微镜进行:

  • 供体和受体荧光团的浓度必须精密控制。 当许多受体分子的环绕单一供体分子发生实现荧光共振能量转移的统计学概率最高。

  • 漂白必须消除,因为该工件可以改变供体到受体分子的比例,并且因此,共振能量转移过程的测量值。

  • 供体的荧光发射光谱和受体的吸收光谱应该具有相当大的重叠区域。

  • 应该有用来激发捐助的波长区域的受体的最小直接激发。 在稳定状态下FRET显微镜测量误差的一个常见原因是供体发射与受体过滤器集的检测。

  • 两者的供体和受体的发射波长必须与检测器的最大灵敏度范围一致。

  • 供体的吸收和发射光谱应该具有最小的重叠,以降低供体到供体的自转移的可能性。

  • 供体分子必须是荧光和显示,以便共振能量转移发生足够长的寿命。

  • 供体应当表现出低的偏振各向异性的方向的值最小化的不确定性(κ-squared)因子。 这一要求被捐助者,其排放结果从层峦叠激发过渡满意。

  • 当使用抗体标记技术,试剂缀合有供体和受体荧光不应改变其生物活性。 任何活性降低,会严重影响所得共振能量转移测量的有效性。

  • 因为荧光共振能量转移,需要供体和受体分子,以具有相应的偶极对准并定位在10纳米彼此中,向其中相连接的分子,必须考虑所用试剂和三级结构。 例如,当供体 - 受体分子可以附着到蛋白质上不同的结构的位置(如羧基或氨基末端),它是可能的FRET不会被观察到,即使蛋白质不相互作用,因为施主和受主分子位于所述相互作用分子的两端。

  • 标记有绿色荧光蛋白的突变体对FRET调查活细胞应该用传统免疫组织化学技术,以验证该标记的蛋白质,采用相同的细胞内的栖息地和属性与天然对应物进行分析。

为了使荧光共振能量转移现象,以提供有意义的数据作为在光学显微镜的工具,既样品制备和成像参数必须优化。 适当的供体和受体的探针在它们被用作分子标记的选择和方式是一个重大的挑战。 另外,一旦一个标记策略,其允许能量转移已经阐明,可以使用很宽的技术光谱进行测量本身。 大多数的定量荧光显微术调查是通过测定荧光发射的强度进行的。 荧光强度为基础的检测FRET的通常通过监测变化的发光强度的在对应于供体和受体生色团的两种波长的相对量来实现的。 当条件合适荧光共振能量转移发生时,增加受体发射(I(A))是伴随着在供体发射(Ⅰ(D))的强度的伴随减少。

虽然在任一施主或受主的相对发光强度的变化可被视为指示共振能量转移的,习惯的做法是利用两个值,I(A)/ I(D)的比率,作为衡量FRET。 比的值取决于供体 - 受体对之间的平均距离,是不敏感的路径长度和体积的激发光束访问的差别。 任何诱导在分子对之间的相对距离的变化样品条件生产中的供体和受体发射的比值的变化。 因此,FRET可以在显微镜由一个相互作用受体荧光团的辐射增加的供体荧光团和检测的优先激发,伴随着供体荧光减少通过由于能量转移猝灭产生观察。 FRET的测量采用强度监测方法被称为稳态荧光共振能量转移成像。

合适供体和受体探针的其吸收和发射光谱特性的基础上选择。 为了获得最大的共振能量转移,供体的发射光谱应基本上重叠受体的吸收光谱。 此外,应该有受体荧光的激发最大值的供体的最小直接激发,并且不应该有在其受体发生发光的波长区域的供体和受体之间显著发射重叠。 在实践中,它可以是难以识别供体 - 受体对满足这些要求。 这种情况通常是由以下事实的市售荧光滤波器集是不能完全有效地,只透过所希望的波长,并且光的一小部分的设计通带外可发送复杂。 除非非常良好表征和控制的表达系统时,供体和受体荧光团的确切浓度可能难以确定。 也可以将所需的自体荧光,光漂白,并且背景荧光的附加校正。

在活细胞中培养的细胞内蛋白质 - 蛋白质关联的典型调查与细胞凋亡,从顺序相互作用的一个复杂的级联导致细胞死亡的一个physicological过程相关联的事件表示在图8。 直接参与的事件链的基因产物可以通过熔化,以通过荧光共振能量转移来探测特定的关联被标记到荧光蛋白家族的适当部件(在此情况下,BFP和GFP),用于共表达在相同细胞。 参与凋亡的蛋白在线粒体内进行交互,并作为程序性细胞死亡进行结合显示逐渐下降。 因此,供体发射的图像(图8(a))包含来自BFP标记蛋白仅荧光,而相应的受体发射信息(图9的(b))示出的信号是由于蛋白GFP标记的(与从一定的贡献供体发射)。 音柱滤波器(如图8(c)),如下所述,揭示了荧光从两种蛋白质之间共振能量转移衍生

之间可能潜在影响的一般荧光共振能量转移测量的准确度的因素,一些是高度特异性的光学显微镜。 在显微镜调查的一个主要目标是获得高清晰度的图像,这需要特别注意的质量和用来之间的供体和受体的吸收和发射波长光谱区别的滤光器的性能。 为了最大化信噪比(而不会有损试样或处理被调查),有必要仔细权衡曝光的强度和时间与激发光的供体和受体荧光团的浓度与检测器效率。 如果供体 - 受体荧光团的浓度过剩,自猝灭可以发生,影响FRET测量的精确度。 漂白是与所有荧光团中的问题,并能影响供体 - 受体的比例,改变荧光测量。 过量照度也可以破坏标本,特别是那些含有活细胞或组织中。

称为施主光漂白荧光共振能量转移(pbFRET),它利用了漂白过程以测量FRET的技术,通常是在固定化标本的研究应用。 基于逐像素分析,该方法已被应用到测量标记荧光团缀合的单克隆抗体的细胞表面蛋白之间的邻近关系。 漂白FRET是建立在理论荧光团是光损伤,只有当它被提升到激发态敏感。 在统计上,分子的只有一小部分是在任一时刻的激发态,因此,荧光团具有较长荧光寿命有患光损伤的概率较高,并表现出较高的速率光漂白的。

支持这一概念的实验证据表明,荧光团的光漂白的时间与它的激发态寿命成反比。 共振能量转移的发生降低了供体分子的荧光寿命,有效地保护它针对光漂白。 pbFRET的计算是基于供体的下降速率漂白相对于测定在不存在共振能量转移的供体。 漂白在FRET研究的测量需要一个相对长的时间内,因而是最适用于固定细胞样品,其中的时间数据是不重要的,从光漂白对细胞功能的影响是不是一个问题。 在某些方面,捐助漂白技术比致敏的排放测量不太复杂,但拟合的时间常数涉及多个组件漂白曲线提出了一些额外的困难。

能量传递效率也可以通过受体漂白技术,其中在供体发射猝灭的改变是通过前值和后选择性地漂白的受体分子进行比较,测定来确定。 在供体荧光强度的变化在同一检体区域的分析,之前和除去受体后,有只需要一个单一的样品制备的优点,并直接关系到能量传递效率对供体和受体荧光。

在显微镜荧光共振能量转移的精确测量需要补偿所有的潜在的误差来源。 一个简单的技术来校正检测供体荧光与受体发射滤波器和受体荧光与供体发射滤波器(由于交叉或频谱泄放通)已被开发出来。 该方法还校正FRET对的供体和受体荧光团的浓度的依赖性。 测量策略,这需要一个最小的频谱信息,利用三个过滤器组的组合,并且可以容易地实现。 供体,FRET,和受体过滤集旨在隔离,最大限度地提高三个具体的信号:荧光捐助,归属于FRET受体荧光,并直接激发荧光受体分别。 在实践中,三种不同的样品,仅含有供体,只是受主,并且两个供体和受体进行检查,每次三滤集,以及算术操作产生的数据以校正交叉和在施主 - 受主浓度不受控制的变化。

示于图9,分别为交叉的示意图(光谱泄放通)和过滤串扰,即必须以实现在荧光共振能量转移实验的定量结果可以克服两个显著问题。 交叉或渗出通过由与图9中的受体发射干涉滤波器的带通区域中的供体荧光发射光谱的重叠表现,从而导致供体发射信号(不需要的波长)穿过发射滤波器被发送。 与此相反,过滤器串音描述了最小衰减(阻塞)级以上的两个滤波器放在一起串联的特定范围内,并且是一个令人关注的荧光集匹配的激发和发射滤波器时。 二色镜通常包括在荧光滤光片组合串扰评估。 尽管2发射滤波器同时很少放置在光路中,频谱被拉到一起在图9同时示出了这两个概念。 注意,这两个滤波器的光谱(蓝色和红色曲线)表示光透射通过所述干涉滤光器,而供体发射曲线(绿色)是强度对波长的曲线图。

额外的因素,这可能引入显著误差,也需要校正时的稳态FRET测量技术采用。 此外,仔细控制供体和受体荧光团的浓度是可取的。 荧光团浓度测定可以通过时间分辨荧光测量,它提供了获得平均寿命,而不给体浓度的精确知识的方法,该应用程序被部分地避免。 该技术能够定量测定的供体 - 受体的间隔距离,并且基于在所述接受体存在和不存在施主寿命的测量。 测量荧光强度衰减作为时间的函数阐明了激发态分子的发射的动态,因此,可以得到大约的供体 - 受体相互作用的性质更详细的信息。 强度衰减的图形曲线说明了荧光衰减过程的时间平均详细信息(参见图10(a)),采用稳态技术时,这是悬而未决。 测量指示用于平均寿命相同的值,当记录为稳态强度归一化到吸收,可以对应于显著不同衰减曲线的形状在时间分辨数据图,表明在所涉及的分子间过程的差异。

荧光团的荧光寿命(τ)是在返回到基态之前存在于激发态的分子的特征时间。 以下的激发光的简要脉冲表示荧光衰减以简化的单指数的形式中,荧光强度作为时间(t)的函数,由下式给出:

I(t) = I0 exp (-t/τ)

其中I(0)是立即激发光脉冲之后的初始荧光发射强度,和I(t)是在时间 t所测量的荧光强度。 荧光寿命(τ)被定义为所需的强度衰减到其初始值的1 / e的时间(约37%的I(0);图10(a)),并且是速率常数的倒数为从激发态到基态的荧光衰减。

时间分辨与稳态FRET测量的主要整体优势是,供体 - 受体间距可以映射更大的定量准确。 这导致部分是因为荧光寿命不依赖于局部强度或浓度,并且基本上不受光漂白的荧光团。 荧光寿命,然而,高度到荧光团环境敏感,甚至分子具有类似的光谱可显示不同的环境条件下不同的寿命。 由于散射不影响荧光寿命,寿命变化的测量可以提供专门与当地的分子过程的信息。

荧光团的寿命受到修饰通过在局部微环境许多变量,包括因素,例如疏水性,氧气浓度,其他媒体成分的离子强度,结合的大分子,以及邻近受体分子,可以通过消耗激发态共振能量转移。 它是一个显著实际优点,即寿命测量可以作为分子间的相互作用为绝对指标,并且是独立于荧光团浓度。

常用来测量荧光寿命两种通用技术被分类为时间域 ( 脉冲的 ,参见图10(a))和频域 (也称为相位分辨 ;图10(b))的方法。 时域寿命测量采用脉冲激发光源,并通过直接测量发射信号或通过光子计数检测得到的荧光寿命。 频域方法利用激发光源的正弦调制(从脉冲或调制的激光系统获得),和寿命从荧光发射信号的相移和解调深度决定。 每种方法以荧光寿命成像具有特定的优点和缺点,并且都被广泛应用到常规广角,共聚焦和多光子显微镜。

示于图10是表示在时域和频域技术测定荧光寿命的示意图。 在时域方法(图10(a)),试样是由激光的具有持续时间比激发物种的寿命短得多的简要脉冲激发,且指数衰减轮廓被测量为时间的函数。 荧光衰减通常是单指数函数的单一荧光,但可以显示更为复杂的人物,如果激发态在环境中提供众多的放松途径。 从连续波激光器耦合到声光调制器正弦调制光被用来激发在频域实验,荧光团(如图10(b))。 所得荧光发射正弦调制在相同的频率作为激励,但是伴随着相移,并减少调制深度。 在一个单一的指数衰减的情况下,荧光寿命可以通过确定相移(φ),或调制比率(M)的任一的程度进行计算,使用图10的(b)中提供的等式。如果这两个值是相同的,荧光衰减是真正组成一个单一的指数函数。 当一个以上的荧光物质是本(或单个荧光团经历一个复杂的环境中),相移和调制寿命应评估在宽的频率范围内。

用于测量荧光寿命的时域技术基本上依赖于单光子计数和要求的检测系统具有足够的时间分辨率,以收集接近100%由每个激励脉冲产生的光子。 虽然相分辨技术相对要求不高执行,他们通常不作为光子计数方法,因为敏感。 当相位调制被用来解决复杂multifluorophore寿命,长的曝光时间,以破坏激发光照可以证明是过度对于某些样品,并且也可以不提供对活细胞的过程足够的时间分辨率。 首选的技术依赖无论从调查和标本类型所需要的信息,正在研究中。

荧光寿命测量已被证明是FRET的敏感指标,并在因寿命测量的许多因素,如浓度和光路长度,这是很难在活标本,以控制独立的活细胞的研究特别的优点。 通过荧光寿命测量进行FRET研究的主要优点在于,它可以区分具有相似发射光谱即使供体 - 受体对之间的能量传递。 当荧光寿命被直接测量(相对于使用稳定状态的值),FRET的判断是可能的,而不供体或受体荧光团的光破坏。 因为FRET通过能量转移至受体,供体寿命的受体(τ(DA))的存在下在不存在受体的直接比较,可以减少施主分子的荧光寿命(τ(D)) ,使的FRET效率值(E(T)),用于每个图像像素的计算。

根据该技术,荧光寿命测量所需要的样品被暴露于高频重复激发光的脉冲,或以连续正弦调制光。 在与活细胞的研究中,高强度的照明效果,必须始终进行评估。 无论采用何种方法,供体的寿命基准时间没有接受实验必须的条件完全相同的供体 - 受体测定下确定。 与单一试样完成这个的一种方法是以下能量转移实验漂白破坏受体的后测量供体仅寿命。

结论

在生物学研究,荧光共振能量转移的最常见的应用是两个站点之间的距离的上一个大分子(通常是蛋白质或核酸)或体内生物分子实体之间相互作用的检查测量。 蛋白质可以带有合成的荧光或免疫荧光团以用作供体和受体,但在荧光蛋白遗传学前进现在使研究人员能够与多种具有不同光谱特性的生物荧光团标记的特定目标蛋白质。 在许多情况下,氨基酸色氨酸被用作内在供体荧光团,其可以耦合到任意数目的作为受主外在探针

如果大分子都标有一个单一的供体和受体,并且两个荧光供体激发态寿命期间不被改变的距离,然后在探针之间的距离可以从能量转移通过稳态测量的效率来确定,如所讨论的上面。 在情况下,供体和受体之间的距离波动周围分布曲线,如蛋白质组件,膜,单链核酸,或折叠蛋白(参见图11介绍的方案),FRET仍然可以用于研究的的现象,但时间分辨寿命测量是优选的。 落入这两种情况下几个生物应用示于图11中,包括构象变化,离解或水解,融合的膜样脂质囊泡,和配体 - 受体相互作用。

虽然各种方法可用于在光学显微镜荧光共振能量转移的测量中,没有一个是完全没有缺点。 有些技术需要更精细和昂贵的仪器,而另一些是基于一定要仔细验证的假设。 某些方法适合于固定标本,但不能应用到活细胞的系统,而其它方法必须包括显著纠正计算或数据分析算法。 这是肯定的,但是,FRET分析显示了在生物应用程序和范围进一步发展的巨大前景。 在仪表戏剧性的改善已经发生,近年来,特别是相对于时间分辨技术。

荧光寿命测量是只完成了极端困难,在过去,现在由成熟皮秒和纳秒的技术援助。 在荧光探针的发展进步产生了更小,更稳定的分子附着生物指标的新机制。 荧光团还开发了具有广泛的固有激发态寿命,和一个显著的努力被放置在荧光蛋白的基因变异更为多样化的发展。 全新的类荧光材料,其中有许多是比以前的荧光团更小,允许分子间的相互作用的评价在较低的间隔距离,保证改善标签的通用性,并导致FRET技术的新的应用。