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徕卡显微镜共聚焦和数字光片影像

2015-05-29  发布者:admin 

光学成像仪器可以放大微小物体,放大遥远恒星和揭示细节,看不见的肉眼。但出了名的患有一种恼人的问题:场深度有限。我们的眼睛镜头(光学成像仪)具有相同的麻烦,但我们的大脑巧妙地删除所有未处于焦点的信息之前,该信号到达意识的认知。 如果图像被保留在一张照片这是行不通的。 通过优化参数,我们可以增加景深,但我们通常失去的分辨率,并在z位置的信息。

如果有可能仅记录特征在聚焦和测量相对z-位置,就可以解决的焦点问题的深度:在记录栈的图像,我们就可以重建整个样品没有模糊的部分和在量化对象所有三个方面。

图1:在一个真正的共聚焦扫描显微镜的光路的示意图图。激发光(蓝色)被耦合到所述显微镜通过分离器,用于入射照明和聚焦成衍射限制光点由物镜1.排放经过分离器,并通过针孔空间滤波。扫描在x和y方向上的光点产生图像,该光学部分。


1.垂直方式 - 共聚焦

最常见的是,我们有共聚焦显微镜记参照光学切片时。共聚焦原理是无缝集成到标准型光学显微镜(虽然技术集成需要相当多的修改)。不同于普通的光学显微镜,真正的共聚焦成像需要一个单点的微小尽可能的照明。光点的直径由波动光学统治并达到衍射极限的最小在d≈λ/ NA。详细的强度分布由点扩散函数来描述。同时,检测器还必须检测一个点的小细越好。作为光路径是对称的,同样的数学应用到一个点状探测器的感测分布。点检测器是通过引入一个针孔孔径成中间像平面中检测路径来实现。 在样本中,照明和检测的焦点必须一致 - 因此“共聚焦”显微镜。如图1所示,该针孔的作用是光学除去不从焦平面所有源自射线。它的功能是,一个空间滤波器在z方向的。

作为光学刀仅适用于在一个时间的单个点,该点必须移动从上到下线以生成图像。强度被同步转换成数字信息,并存储在计算机上的帧存储器。从该电子存储器,该图像被显示的普通显示器上。作为图像必须由点来构造顺序点,高帧速率是唯一可能的下影响的帧格式和所接受的信噪比有一定的限制。高度透明的光束路径,例如徕卡SP检测器,并且非常有效的传感器,如混合探测器(HyDs)有助于提高高帧速率的性能。同时,线频率高达12,000赫兹共聚焦显微镜实现,相较于CA 15000赫兹线频率在PAL标准的电视。在适当条件下,帧速率高达约每秒500是可能的。然而,为了获得足够高的信号 - 噪声图像,帧速率将通常不超过每秒约10帧。奥林巴斯显微镜

涉及到扫描过程的另一个问题是上方和下方的焦平面样品的区域被暴露于不向图像高量的照明能量的,但可能会导致荧光的光物理降解。作为荧光染料吸收光也高于焦平面,荧光强度越来越暗深聚焦到样品时。这可以补偿对由自动增益调整的手段,但在信号与噪声的成本。

真共聚焦成像的积极方面是高分辨率(高NA透镜容易应用),但事实上,该图像是在焦平面固有均匀和标准制剂以共聚焦显微镜容易且毫不费力地进行分析。共聚焦显微镜是基于标准的同轴光显微镜,和所有标准的显微镜方法和对比度模式可访问的显微镜由一个简单的开关。 它也是其它类型的扫描显微镜的基础上,像多光子激发,高次谐波产生显微镜,相干反斯托克斯拉曼散射显微镜和超分辨率技术STED(受激发射损耗显微镜)。


2.水平方向 - 光板

虽然共聚焦显微镜是黄金标准光学切片,第一显微镜来执行此任务前出台了半个世纪。该“的Spalt-Ultramikroskop”采用了明亮的光源(弧光灯或太阳),它集中成一个狭缝孔。第二透镜,通常是一个重复使用的物镜,投射该缝隙入试样正交于显微镜的光轴。这种设计有效地创造了一些2微米厚度的片材状照明。原来的应用程序所关心的次分辨率颗粒,像彩色玻璃分散黄金。然后,它证明了各种胶体样品和混浊介质的,这是在化学和医学研究中常用分析是有用的。这种早期光片显微镜仅限于向下形象化的微小粒子,以5纳米,这会导致可观察到如在显微镜的垂直光束路径中的衍射图案的照明的球形散射。 其结果是,它可视不可分辨的颗粒,被称为“Ultramikronen”,这是“超越显微镜的分辨率”。命名为“超分辨率显微镜”建议设计的超分辨型摆在首位,但它变得平坦了作者的超显微镜显然受到光学衍射。


图2:在的Spalt,Ultramikroskop光路示意图图。激发光被正交聚焦物镜1通过狭缝(的Spalt)进入样品。发射由物镜2收集,并且可以通过照相机作为光学部分被记录。


后来,设计被开发了规避了精度狭缝和采用桶透镜来创建光的片材在垂直于光轴。这种布置然后用荧光,固定的样品。光片显微镜证明对厚的样品的快速实时成像特别有利的,作为漂白不太明显和图像记录并行地执行由数码相机共聚焦和数字光片影像如图赫伊斯肯。在z方向上的吸收是不是一个问题,因为该照明等于在Z中在其上的显微镜被聚焦的所有位置。但是,发射光必须通过样品象在一个普通的显微镜,这可能会恶化图像以厚的样品在一定程度上。尽管如此,有在横向方向上的阴影效应:光被第一吸附在那里的照明光入射到样品的一侧,因此荧光变暗的相反侧。Vo1E时对于这种效应的补偿,通过转动样品和从不同方位收集图像。Dodt照射从两个相对侧的样品,以补偿光片的吸收。代替使用投射狭缝孔或圆柱透镜,凯勒扫描一个薄的激光束在垂直于观察轴线。这项计划被称为“数码扫描光片”。

图3:一个相干融合为真共聚焦扫描和垂直方向转动的数字光片扫描光路的原理图图。有关细节请参见图例图1和2。这种配置允许光学切片的两种模式之间无缝切换。


3.结合

两种范例已在生物医学研究和常规被引入,服务于许多新的见解和生物的概念和疾病的理解,和细胞组分的结构和功能的影响。 在仪器方面,两种方法都显著不同,正交照明被视为系统的一个独立部分,并结合一个同轴显微镜以执行任务。共聚焦显微镜使用光束扫描系统来创建二维图像,数字扫描光片采用波束扫描创建行区域。这立即引起了它是否可能以两种策略组合在一个单一的系统的问题。徕卡引入了新的Leica TCS SP8中的DLS光片显微镜这样的组合。

徕卡TCS SP8 DLS是基于普通共聚焦显微镜,通过借助于一检测针孔的空间滤波离焦的光进行光学切片同轴扫描装置。通过该移动,在两个横向方向上的照射点振镜扫描镜装置产生的图像。为了将这些系统成数字光片显微镜,必须使照明光束垂直于光轴穿过样品。 通过引入小的镜子在焦平面的位置,就在观察视野,所需的正交照明实现。这样的偏转反射镜被机械地连接到观察透镜,以确保被照射的z位置总是在图像生成光学元件的焦点,而图像投影到摄像机的强度转换成数字图像。

照明光束的单个位置不会引起二维图像,但只有一行。一个可利用的横向扫描方式的共聚焦点显微镜固有实现扫描在垂直方向上的照明线,得到所需的两维平面中的一个。

如果第二反射镜的相反侧引入,有可能通过同一透镜照亮从两侧的样品-仅通过使用共聚焦显微镜的光束扫描装置的第二轴线。这满足了需要补偿的吸收引起的阴影。最终的图像,然后再次构成从两个图像具有不同的照明方向。

成像在共聚焦模式下,在z驱动机构具有被定位以使照明光束的焦点与特征是将被成像重合。扫描过程然后覆盖视场,这是操作一个共聚焦显微镜的常见方式的正好内侧。要切换到光片采集,聚焦具有由反射镜的左右到光轴的距离上移动。在这种情况下,照明光束的平面产生部分将落入观测场的中心。扫描装置需要指向视场的边缘,以打到镜。

这种结合不仅降低成本的仪器,作为两个不同的乐器被合并成一个,但它也可以让经典的共聚焦和数字光片显微镜的组合。其结果是,在同一系统允许任何血样与是为解决目前的研究问题最合适的技术进行研究。它还使各种新应用机会由于共聚焦路径可用于光操作与的诱导的作用随后平缓光片成像。