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徕卡显微镜FRET与FLIM定量在体内生物化学

2015-05-11  发布者:admin 

荧光寿命是多久荧光团保留在平均在激发态通过发射荧光光子返回到基态之前的量度。它依赖于荧光团的分子的组合物和纳米环境。

FLIM结合寿命测量与成像:为每个图像像素获得的寿命是颜色编码,以产生更多的图像对比度。因此,FLIM有关其生化状态或纳米环境的信息提供关于荧光分子的空间分布的信息一起。FLIM的一个典型应用是FLIM-FRET。FRET是一个行之有效的方法来研究分子间的相互作用。它审视蛋白结合,并估计在一个规模埃距离间也。


FRET - 原理

荧光共振能量转移(FRET)描述的能量存储在激发的荧光分子(供体),以非激发不同的荧光分子(受体)在其附近的非辐射转移。 三个条件必须满足FRET发生:

  • 供体发射光谱与受体的激发光谱重叠(图1)

  • 分子必须在接近上一个纳米(10 -9米)规模(图2-4)

  • 分子必须具有相应的相对方向

图1:供体(ECFP这里,蓝线)的发射光谱必须与受体的激发光谱(这里EYFP,黄线)重叠。这个要求意味着两个分子在FRET对具有兼容的能量水平。 


图2:供体分子(D)是通过从受体分子(A)的距离为r隔开。


图3:在距离r小于阈值R 0,也称为福斯特半径大得多,没有能量传递。

 

图4:如果分子处于紧密接触能量从激磁光子(蓝色箭头)被传非辐射到受体。 反过来,后者发射光子(黄色箭头)。 这个处理(E)的效率强烈地依赖距离为r -6。


影响

由于其随r强距离相关-6(图4)的FRET发生在一个空间尺度是用于生化反应,如蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用高度相关。 FRET可以通过灵敏的荧光读出探测分子间的相互作用。 这使得研究人员研究在体外和体内分子间的相互作用。通过将与适宜的荧光标记感兴趣的两个相互作用配偶能够分析双分子相互作用。可替代地,FRET允许生物探针报告的第二信使或离子强度由分子内FRET的手段浓度的结构,由于强的构象变化。

毫不奇怪,FRET已发展成为细胞生物学,生物物理学和生物医学成像广泛使用的工具。


该方法

有不同的技术来检测FRET在显微镜的情况下。俗称的基础上无论是供体(受体 - 漂白,FRET AB)或受体(致敏的排放,FRET SE)的荧光强度的技术。

基于强度的FRET可以使用标准共焦显微镜可以容易地应用。 然而,它也有一些缺点。FRET AB不能在时间系列实验被应用并易受可逆漂白的供体分子或光转化。FRET SE,另一方面,患有光谱串扰固有所有FRET对,需要仔细校准测量以及产生的图像的线性分解。 本申请书介绍了一种不同的方法来测量FRET是基于荧光寿命成像显微术(FLIM)。


荧光寿命

荧光的过程常常被理解分子中(图5,左)从电子基态(S 0)到激发态(S 1)项的能量转换。这种转变可以由入射光与适当的能量(即频率或波长)被引出。 所吸收的能量被荧光分子存储短时间才可以发出荧光。一个分子在其激发态的时间被称为荧光寿命。 它典型地在纳秒(10 -9秒 ),用于许多有机染料和荧光寿命蛋白质的顺序。


荧光寿命和FRET

另一种方法,以放松从激发态是,例如,FRET。通过FRET激发能量是非辐射地转移到受体分子。反过来接受器可以通过荧光(图5,右)放松。 由于供体荧光和能量转移是竞争过程的消耗率的激发态增加FRET的存在。有人可能会说,时间越长,供体分子度过处于兴奋状态就越有可能的是,FRET发生。 仅仅从供体分子的光子通过它放松荧光观察。能量转移到受体分子不因受体荧光的波长更长的检测。 因此,FRET缩短寿命捐助(图6)。


图5:在FRET对能源的过渡。 光能匹配的供体分子的过渡被吸收(蓝色箭头)。 兴奋的捐赠者可以放松或者通过荧光(灰色虚线箭头,左)或共振能量转移到受体分子(黑色箭头)。 


图6:激发后绘制的荧光光子数在经过时间。 激励脉冲后发射的光子的初始数量,一个0,呈指数衰减。 荧光需要时间衰变到一个0 / E(〜37%)是荧光寿命。 寿命τ转移到更短的时间,由于FRET(τ淬火 )。另一种读出从寿命衰减幅度为0。在扫描系统中的每个位置测量的寿命产生寿命(见插图)的空间地图。


荧光寿命成像(FLIM)

使用脉冲激光器和单光子计数探测器在Leica TCS SMD系列测量在时域荧光寿命。寿命是通过建立检测荧光事件的直方图来确定。这揭示了一个单或多指数荧光衰减。 数值曲线拟合呈现荧光寿命和振幅(即,检测到的光子数)。

奥林巴斯显微镜

FLIM-FRET

由于FRET减少捐助寿命可以量化到FRET发生时,提供无FRET供体的寿命是已知的程度。这个供体寿命τ用作绝对参考针对其FRET样品进行了分析。 因此,FLIM-FRET是内部校准 - 一个属性减轻许多的基于强度的FRET测量的缺点。因为它的荧光寿命是一种染料的固有属性是广泛不变的,否则不利影响如漂白,图像阴影,不同浓度或表达水平。

主要的使用限制强度基于FRET测量的基本假设所有观察到的捐助分子发生FRET。这通常不是这样的。 供体分子的这种变化的“绑定”部分介绍了相当大的不确定性所测得的FRET效率,使实验无法进行比较。 FLIM-FRET克服了这一缺点。


拍摄使用活细胞图像FLIM

如前面提到的,FRET效率从微动施主寿命τ 骤冷过的非微动寿命τ作为的比值来计算:



为此τ必须从测量使用包含施主只有一个样品已知的。 它排除从受任何排放量是很重要的。 使用外部检测器必须使用一个带通滤波器。 内部检测器可被调节以只记录供体发射。 相同的设置,必须同时用于donoronly测量以及使用FRET样品的测定。


CFP-YFP FRET活细胞

在这项工作中,我们使用培养RBKB78细胞瞬时转染了荧光共振能量转移构建体组成的CFP-YFP的融合蛋白质(图7)的。 两个的FP通过两个氨基酸的短的接头连接。这样的供体 - 受体融合也可以作为在真实的场景中一个很好的阳性对照FRET。“捐助唯一的”样本包括转CFP只(图7A)相同的细胞。 作为第一近似的平均寿命是计算在快速FLIM的模式,对于两个,只有供体和FRET样品(图7B)。寿命分布直方图显示,供体的平均寿命τ是2.1纳秒(图8)。在FRET结构的供体的寿命是1.4纳秒。 其中获得一个FRET效率E = 1 - (1.4 / 2.1)= 33%。

顶行:图7:RBKB78细胞转染与CFP供体只(A)和CFP-YFP融合(B)。 该检测范围是使用光谱FLIM探测器设置445-495纳米之间。 着色区域已被用于分析。 颜色代表调强荧光寿命。 礼貌教授格雷戈里·哈姆斯,维尔茨堡,德国的大学。 我们承认实验支持由本尼迪克特克莱默博士(Picoquant,柏林),扬 - 亨德里克Spille和WIEBKE巴克<BR>下排:图。 8:供体荧光寿命分布只(黄色),并使用平均寿命FRET(绿)的样品。 还有就是0.7纳秒对FRET样品中寿命较短一个明显转变。


FRET的比例与无FRET

它是已知的CFP到具有至少两个寿命部件在自己的权利。此外,它是不知道所研究的所有分子是否发生FRET先验。为了公平对待这种复杂性人们需要对超过平均寿命的信息。我们可以进行双组分配合,这将给我们两个人的寿命和两个振幅。后者允许我们估计一个人一生中的相对比例比其他。 特别是,使用的振幅,我们可以估算该分数表现出FRET(结合级分)和未表现出FRET(未结合部分)的级分的相对比例。 fps的微弱第二部分,如EGFP或蓝宝石非常适合这种类型的分析。