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徕卡显微镜低温荧光显微镜与低温电子显微镜组合

2015-04-17  发布者:admin 

许多生物的见解可以通过组合荧光显微镜(FM)与电子显微镜(EM)的力量来研究同一样品获得 - 这就是所谓的相关光学和电子显微镜(CLEM)。 在FM,特异性蛋白可被标记和识别,并且其动态和交互可以在固定或活细胞可视化。在EM中,充分的环境的上下文中可以看出,能够得到高分辨率的细节。在这篇文章中,我们介绍CLEM的理念,特别注重对低温CLEM:低温FM与冷冻EM的组合。


荧光和电子显微镜的局限性

当研究在细胞内或在分子间的相互作用的水平的生物事件,科学家经常被调频的空间分辨率的限制。所谓的“超级分辨率”的方法大大有助于克服这种限制,以允许单个荧光标记的,其分辨率达几十纳米的本地化某种方式。调频也是有限的,因为它仅视像化的荧光标记物,并没有提供关于在此标记被观察到的结构和形态学的上下文信息。该第二限制也可以是一个优点,因为它提供的特异性,从而允许标记的分子在一个致密的海未标记的分子来鉴定。

相反,观察具体的标记分子,EM形象化的电子密度的地方差异。这使它成为理想的技术来分析大分子复合物的结构或描述细胞形态和环境。在EM中,但是,它难以直接区分特定类型的分子。在CLEM实验,调频和EM都进行了同样的样品,以从调频链接特定的或动态的信息,具有高分辨率或自EM的环境信息。

为TEM和低温EM样品制备

理解CLEM的挑战,有必要检讨了EM样品的性质。 在透射电子显微镜(TEM),电子束照射的样品和投影图像被记录。当A投射到试样,被加速的电子相互作用和被吸收或散射。样品需要足够薄的电子束穿过样品。由于存在于显微镜柱的真空,样品也需要在干燥,固体状态下它们不会立即分散到真空将被成像。

生物标本用于TEM中最常见的制备方法是按顺序更换所有的水样品通过醇,然后嵌入与被聚合的树脂,从而产生固体块。此块然后用切片机,得到切片的TEM成像足够薄切片。以提高对EM图像的信号和对比度,可样品制备过程中加入电子致密材料,例如重金属染色。

用于样品制备的替代的可能性是迅速冻结的样品玻璃化所有包含的水。 这可以通过快速切入含薄标本为液化天然气,如乙烷网格或通过使用高压冷冻装置,随后冷冻切片来实现。这种技术的好处是,样品保持水合以紧密到天然状态和其分子结构被最佳保留。 由此产生的“低温的样品”可以然后在EM成像(这是冷冻EM),只要它们保持在任何时候都在温度接近液氮。奥林巴斯显微镜

在冷冻的EM图像对比度的效果仅由在生物分子和周围的冰之间的电子密度的差异。因此,该图像包括对样品的分子结构的信息。冷冻EM可以达到<5纳米单个图像分辨率。当与计算的平均方法相结合,所关心的蛋白质的结构可以在最好的情况下得到解决,以0.3纳米的分辨率。

两种方法CLEM

取决于所使用的EM样品制剂的类型,并且取决于调频的类型而进行的,人们可以使用不同的CLEM方式。一种方法是进行活细胞荧光成像制备样品用于后续EM之前。这使得在FM和EM观察状态之间至少几秒钟一个典型的时间间隔,由于同时固定或固定化样品损失的时间。因此,这种策略并不理想,研究快速移动过程或信号非常精确的定位。第二种方法是,既发挥EM和FM在相同的样品,一旦它已准备EM。此过程提供高相关性的精度。这第二种方法可应用于嵌入在特定的条件下树脂样品。它也可以适用于冷冻样品 - 这是低温CLEM。

挑战和低温CLEM要求

冷冻CLEM的特殊挑战是必须保持样品温度低于-140℃的任何时候,以避免形成晶体的冰,并且该样品不能暴露于湿度,以避免水的凝结。这些条件必须保持在所有阶段,包括调频中,并同时将所述样品制备设备,荧光显微镜,及冷冻EM装有TEM之间的样品。

冷冻的CLEM需要配用特殊的冷冻阶段在成像期间保持低样品温度荧光显微镜。在冷冻阶段,必须将试样的污染引起的环境湿度结霜最小化。一个理想的系统的光学性能应使高分辨率成像灵敏度高,以允许高精度的相关性。

许多低温阶段和相关的工作流已经开发了用于冷冻CLEM。这些包括反转配置,其中所述显微镜物镜从样品通过载玻片分开,以及使用长工作距离的物镜直立设置。我们利用一个堂堂正正的显微镜配置和冷却的物镜面前,让我们的冷冻FM设置采用高NA物镜,用短的工作距离,同时保持陶瓷成功冷冻CLEM标本。

工作与我们原来的设置,在描述提供了经验促成了徕卡EM冷冻CLEM解决方案(图1)的开发。这种解决方案使得能够以更可靠的和直观的方式进行冷冻CLEM。

图1:徕卡EM低温CLEM系统。


为什么冷冻CLEM这样有用吗?

冷冻CLEM使我们能够找出感兴趣的生物对象(这可能是动态的,罕见的,或以其它方式难以找到),根据它们的荧光信号。 然后,我们可以找到非常相同的对象,将获得的高分辨率结构数据,在上下文中,通过冷冻EM(图2)。 在许多情况下,这样的信息不能以任何其他方式来获得。

图2:A)低温FM一个GFP标记噬菌体的图像(圆圈白色)。 标记为黄色多色信号从荧光微球起源。B)的样品的相同部分的低温EM概览图像。标记A中的微球再次标记为黄色。它们的位置用于定位所述荧光噬菌体的坐标中的冷冻的EM图像。 C)高倍率冷冻EM图像的识别坐标。 圆圈指示信号,其内的噬菌体被看见的预测起源。