设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

奥林巴斯显微镜的漂白

2015-04-15  发布者:admin 

荧光团永久性地失去由于荧光向光子诱导化学损伤和共价修饰的能力漂白的现象(也通常被称为衰落 )发生。 当从激发单重态到三重态的跃迁,荧光团可以与另一个分子相互作用以产生不可逆的共价修饰。 三重态是相对长的寿命相对于单重态,从而使受激分子一个长得多的时间内经受化学反应与环境中的部件。 的发生为光漂白前的特定荧光团的激发和发射周期的平均数目是依赖于分子结构和当地的环境。 某些荧光漂白迅速发出只有几个光子后,而其他人都更强大的可漂白前经过成千上万次的。 这种互动式的教程探讨变化中的漂白率在单,双,和乘荧光标记标本。

本教程初始化一对出现在本色形象光漂白图像窗口相同的荧光图像。 为了操作教程,点击快门按钮以极大的夸张速度在一个固定的时间内打开虚拟快门,让光漂白图像图像褪色或光漂白。 褪色可以在任何时候通过点击暂停按钮(这成为一个开始按钮)暂停,然后继续单击开始按钮。 在双和三标标本,各种单独的荧光漂白率可以单独使用颜色通道复选框被看作(默认设置是所有通道打开)。 例如,点击与三重标记标本复选框,将只显示红色通道。 两个或所有三个颜色通道的可混合在一起使用添加复选框乘法标记标本。 一个新的样本可以使用选择的样本下拉菜单中选择。 样品名称包括以下荧光团标记信息:FITC,荧光素异硫氰酸酯; ,红色,绿色和蓝色荧光团;  ,两种荧光团; DAPI,4',6-二脒基-2-苯基; MitoTracker,线粒体探针;Alexa的488,绿色荧光; 自动 ,自发荧光。 本教程的目的是在装上随机改变光漂白率个别荧光,使点击快门按钮,反复将演示如何将图像显示为荧光漂白率的变化对每个颜色信号。

因为光漂白,非常了解甚少的现象,导致荧光发射强度的大多数试样急剧损失,控制该工件是为了成功地捕捉到了良好的图像的关键。 作为一个典型的荧光染料的例子中,量子产率的荧光素在中到高照度光漂白决定了的平均分子将发射在其使用寿命为30至40000光子(变得永久禁用之前)。 此外,激发和发射周期的数目是恒定的一个给定的荧光团不论激发能量是如何传递,无论是在离散的脉冲,或通过连续的照明。 因此,通过使用中性密度滤光片不阻止光漂白减少激发光的水平,它仅仅降低的速率。奥林巴斯显微镜

示于图1是光漂白(衰落)的一系列在小鼠小肠的乘法 - 染色的低温恒温器薄膜部(16微米)的不同时间点拍摄的数字图像的观察的一个典型的例子。 分别对细胞核进行染色,SYTOX绿(绿色荧光),而杯状细胞,并在刷状缘的丝状肌动蛋白的粘液沾满的Alexa Fluor 350麦胚凝集素(蓝色荧光)和Alexa Fluor 568鬼笔环肽(红色荧光), 。 时间点采取了使用与带宽调整为同时激发三个荧光同时记录相结合的发射信号的荧光滤镜组合两分钟的间隔。 需要注意的是所有这三个荧光团具有相对高的强度在图1(a),但将Alexa Fluor 350和568(蓝色和红色)的强度开始两分钟迅速下降,并几乎完全消失了以六分钟。 绿色染色的核是漂白更耐磨,但它们的强度也下降稳步在定时序列(10分钟)的过程中。 各种各样的合成的抗褪色试剂将显著减少漂白率。

漂白事件的一类重要的是光动力 ,这意味着它们涉及荧光团与光和氧的组合的相互作用。 荧光团和分子氧之间的反应永久性破坏荧光并产生游离基的单线态氧物种可化学修饰的其它分子中的活细胞。 漂白由于光动力学事件的量的分子氧浓度和荧光团之间的距离近,氧分子,以及其它细胞组分的函数。 漂白可以通过限制荧光团的曝光时间的照射或通过降低激发能量被减少。 然而,这些技术也降低了可测量的荧光信号。 在许多情况下,荧光团或细胞悬浮液的溶液可以是脱氧,但是这不是对活细胞和组织是可行的。 也许对漂白最好的保护是限制荧光激烈照明(使用中性密度过滤器)再加上明智地使用可添加到安装溶液或细胞培养基中可商购的抗褪色试剂曝光。

在某些情况下,光漂白作用也可以用于获得该否则不会提供特定的信息。 例如,在光漂白FRAP实验后的荧光恢复,目标区域内的荧光团被有意漂白照射过量。 随着新的荧光团的分子扩散到检体(恢复)的漂白区,所述荧光发射强度进行监测,以确定目标荧光团的横向扩散速率。 在这种方式中,荧光标记的分子的平移移动性可以在单个细胞或活组织的部分的一个非常小的(2〜5微米)的区域内被确定。