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徕卡显微镜STED显微镜活细胞的光明染料

2015-01-22  发布者:admin 

细胞生物学的目的是研究优选在活细胞试验在细胞水平上最小的细节。 通过提供快速和直接超分辨率,STED(受激发射损耗)显微镜是用于研究细胞的细节在纳米范围内体内的完美工具。 对于活细胞的超分辨率的最佳染料必须是明亮,光稳定,没有显示光毒性,理想地发射的远红外光谱,并可以在活细胞中被应用。 最近一类新的硅-罗丹明(SIR)衍生物已报道满足所有这些标准。探头专门染色细胞骨架和标签SNAP标签的融合蛋白是目前市场上买到,取得优异成绩受激发射损耗。


硅 - 若丹明的光谱特性

硅 - 罗丹明(SIR)是结构上相关的公知的家庭若丹明荧光团(例如德克萨斯红和TMR:四甲),但显示出各种明显不同的和有利的特性为在活细胞显微术实验的应用(参见图1为结构)。 SIR是一个明亮和远红色荧光团具有约650和670纳米,其中很少的自发荧光和光毒性发生光谱范围的激发和发射波长。 长波长允许高穿透深度,从而更深层次的成像。

图1问:主席先生,基于探针活细胞成像。 (a)在该荧光两性离子(开放)的形式和非荧光螺(闭合)形式之间的平衡存在SIR衍生物。 探针的配体的靶结合有利于荧光开放的形式,而游离,未结合的探针SIR主要存在于封闭的非荧光的形式,由可逆疏水聚合想必稳定。 (二)在本次审查中描述SIR衍生物的结构。 只有荧光团的封闭螺形式被示出。


非常重要的是,SIRS已被证明是膜渗透性并因此允许染色活细胞中没有繁琐的转染方案。

爵士衍生的另一个重要特点是其荧光字符。 根据它们的环境,它们可逆地采用非荧光螺内酯形式(OFF状态),或一个高度荧光两性离子形式(ON状态),分别为(图1)。 导通状态被结合到反应伙伴青睐。 因此,通过适当的设计SIR-荧光团基于探针,荧光在靶结合一个超过100倍的增加得以实现。 其结果是一个高度敏感的成像具有低背景水平,即使没有通过洗涤步骤除去多余的探针


在细胞特异性染色

利用SIR的染料活细胞成像需要的目的蛋白的特定标签。 在一般情况下,这是通过SIR的耦合到靶向配体来实现的。 例如,SIR衍生物特异性与自标记蛋白质标签,如SNAP-,夹子或晕蛋白标记反应已经描述。最流行的自标记蛋白质标记是SNAP-标签和相应的SIR衍生物(SIR-SNAP,图1)是市售的。 SNAP-标记是20 kD的特异性,并迅速用苄基反应的小蛋白(BG)衍生物携带荧光团诸如SIR。这允许在活细胞中,甚至在体内的SNAP标签融合蛋白的特异性标记。 SNAP标签融合蛋白与SIR的标记在很大程度上受染料的荧光性质容易,一旦转移到SNAP标签即其在荧光强度增加。 一个例子突出SIR-SNAP的电位的SNAP-标签表达在大鼠脑切片的皮层神经元的特异性和高效的标签。

使用自标记蛋白质标记,如SNAP-标签仅限于细胞和生物体是服从转染或遗传操作。 细胞骨架是一个结构的量直接荧光探针是相当有用的,因为它涉及了大量的生物过程。 要生成合适的探针对细胞骨架的活细胞成像,爵士是结合到微管和F-肌动蛋白配体多西他赛和desbromo去甲物jasplakinolide,分别为。由此产生的SIR微管蛋白和爵士肌动蛋白探针(图1),现已通过公司Spirochrome,具有很强的荧光,而且非常适合用于活细胞成像(见图2),因为它们显示非常低的毒性。 当施加到HeLa细胞,SIR-探针不与形成有丝分裂细胞骨架中的探针浓度足够高的用于成像干扰:正常中期,后期主轴形态以及卵裂沟的正常外观观察在100nm SIR存在肌动蛋白或SIR-微管蛋白,分别。 无论是分裂的持续时间也不增殖率受到影响,在这些浓度。 SIR肌动蛋白与SiR微管蛋白从而允许正常的分裂细胞的细胞骨架的成像而没有任何明显的毒性作用。 此外,它们的红移激发波长最小化光毒性效果经常看到的探针在较短波长。

 

图2:SIR-肌动蛋白和微管蛋白爵士在HeLa细胞活成像。 共聚焦和STED图像对比。 图片:徕卡。


超高分辨率成像爵士衍生物

所有超分辨率方法依赖于染料的荧光和暗态之间的切换。 因此,可达到的分辨率依赖于染料的光谱性质。 明亮的荧光,耐光性和低光毒性呈现爵士衍生物特别适合于超分辨率显微镜。 证明型的原理的实验表明,SIR衍生物可用于GSDIM / dStorm(基态耗尽接着个别分子返回/直接随机情形光学重构显微术)和SIM(结构照明显微镜)。 但特别STED显微镜和爵士为基础的探头相结合是一个非常强大的办法进行超分辨率的活细胞显微镜。例如,利用STED显微镜和SNAP标签的融合蛋白的SIR-标签被利用,以确定以前所未有的分辨率活细胞中心体蛋白的定位。 然而,最令人印象深刻的成绩一直在使用活细胞STED显微镜和SIR-actin和爵士微管蛋白来实现的。奥林巴斯显微镜

SIR-肌动蛋白标记和STED显微镜证实了环状肌动蛋白结构在活初级大鼠海马神经元轴突的轮圈(图3a,b)中。 肌动蛋白中的轴突这种规则空间排列已经首先通过超分辨率显微镜用X庄的组观察到对固定的样品.重要的是,肌动蛋白在轴突相同的周期性,现在观察还现场样品。 生物结构在活细胞中的特性是非常重要的,因为它避免了固定工件。

类似的观察结果与爵士 - 微管蛋白制成。 该中心体的外周的微管和微管可在SIR微管蛋白来揭示染色由STED显微镜活的人成纤维细胞与在活细胞中实现了迄今用于成像微管的最高分辨率:所测得的微管的直径在这项研究中约为40纳米(图3c)。 这也表明,探针直接靶向微管或其他感兴趣的结构可以显著提高分辨率:微管标记有SIR-SNAP和微管结合蛋白的活细胞STED显微镜产生微管的直径约80纳米,即2倍下比与SIR-微管蛋白得到解决。 此外,STED显微镜与SiR微管蛋白的结合允许首次在活细胞中的中心粒的体系结构的直接可视化。 中心体的关键部件是中心粒,九个三胞胎微管构成的圆筒状的结构。 在成像沾上爵士微管蛋白的人成纤维细胞中心体透露环沿其外围(图3D)呈现明显的调节亮度。 相邻最大值之间所测量的极角等于大约40°,这是与中心粒的已知9倍对称性完全一致。 这些和其他的活细胞STED显微镜实验用红外探头基础的展示方法的巨大潜力。

 

A)                                                                      B) 

 

C)                                                      D)

图3:活细胞STED显微镜。 A)STED图像显示沾满爵士肌动蛋白的大鼠原代海马神经元轴突。 比例尺,1微米。 B)的SIR肌动蛋白条带的强度测量的信号轮廓配合到多个高斯分布和估计相邻峰之间的间隔。 的约180纳米的结构的测量周期是固定的样品中所测量的周期性的实验误差范围内。 C)微管沾上爵士微管蛋白在人类原发性皮肤成纤维细胞图像。 沿着白虚线测量的微管的直径为约40纳米。 d)在理查德森 - 露西去卷积后中心体染色微管的代表STED图像; 所观察到的环是沿其纵向轴线的中心粒的投影。 测得的极角在两者之间相邻的荧光强度的最大值沿中心粒的周边测得为大约40°。 的中心粒的直径,结果为176左右纳米。


最佳的染料

总之,硅 - 若丹明衍生物非常接近最优探针活细胞超分辨率显微镜,因为它们

明亮,光稳定;

很高兴在远红;

有荧光;

显示毒性小; 和

是细胞渗透和生物相容性。

STED显微镜与爵士染料在非常高的分辨率,适中的漂白提供了明亮的图像。 一句话:SIR-基于荧光探针和STED显微镜是完美匹配低于衍射极限的活细胞成像。