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徕卡显微镜TIRF在生命科学研究中的应用

2015-01-11  发布者:admin 

TIRF显微镜的特殊特征是倏逝场的荧光激发就业。标准视场荧光照明与程序不同与弧灯、 发光二极管或激光器,倏逝场只有大约 100nm开始从盖玻片/介质界面渗透标本。这允许"加法"光学切片的标本,起价在非常高的轴向分辨率,盖玻片,并为特定的应用程序带来几个优点。


TIRF显微镜技术优势

TIRF 显微镜的一大优势是其优秀的信号噪声比。由于低渗透深度的倏逝场,焦点出荧光减到最小,因此几乎没有任何背景荧光发生。因为只有部分单元格暴露在电磁的倏逝波的能量,生产的有害的氧,因此细胞的光毒性应力大大降低以及。这极大地提高细胞活力,并允许更长的试验时间。此外,水平较低的光漂白只发生在一个小区域的单元格。正从胞浆进入这一地区的新荧光稳定流量,信号噪声比保持不变的一长段时间。此外,荧光适合 TIRF显微镜 (例如 EGFP,荧光 4 等) 的范围较大,仅限于由可用激光线,以便活细胞成像技术,如烦恼、 FRAP、 钙成像等都很容易执行。光敏感摄像机的连接使高速图像采集的观察快速事件。此外,TIRF 显微镜可以结合其他微观的技术,如免疫荧光显微镜和明视场对比方法。TIRF 显微镜的一个缺点是到目前为止只贴壁细胞可用于实验,为扇区,例如,并非一般靠近倏逝波穿透试样的盖玻片/介质界面。

TIRF显微镜在生命科学研究中

通过采用的荧光激发倏逝场空间受限,TIRF显微镜允许观察定位及分子和附近等离子膜光学切片过程动力学 (通常大约 100 nm)。这是便于处理进程处于或接近细胞质膜的许多应用程序。

TIRF显微镜是一种优秀技术结合现场样品中或甚至在体外与空间信息的动力学研究。它经常用于调查分子贩卖它如发生在细胞骨架程序集。快速图像采集和杰出的背景消除在 TIRF 显微镜提供精湛的观测动态事件像质膜蛋白的招聘条件。因此,动力蛋白/驱动蛋白介导转运的动力学可以追究,举个例子。它也是能够跟踪整个的细胞器,如线粒体利用 TIRF显微镜。在细胞间相互作用进行调查,像细胞粘着的特殊结构很容易可以被可视化与 TIRF 显微镜观察例如招募到粘着斑骨架零件。

无与伦比的信号噪声比和 z 决议的 TIRF 显微镜相结合 (例如形心跟踪方法) 的数学模型,由subdiffraction 有限公司定位的单分子是可以实现的精度为 1 nm。这是视图的样品的可能的如由倏逝波的荧光激发产生低背景荧光从焦点出荧光,导致低信号-到-信噪比 (如乘以字段的区域中的倏逝波的穿透深度) 定义卷中。在传统的基于 lamp 的荧光系统将兴奋并同时所有荧光束路径中的,然后将其检测到没有任何有关他们的 z位置的信息。(奥林巴斯显微镜)

换句话说: 三个三维空间分布的荧光显示在只有两个维度,如不同的 z 平面的单元格显示为一个平面中获取的图像。这将导致在堆焊荧光在图像中,往往使得单个荧光斑点的歧视是不可能。在 TIRF 显微镜,只有大约 100 nm深倏逝波内荧光相对较小数目然而,被激动,提供样品光学 z 段。

TIRF 图像在 x 和 y 方向的荧光斑点的空间距离是相对较低的因为从其他 z 平面荧光发射的光不叠加的检测到的信号。然后应用数学模型 (例如形心跟踪方法) 来计算检测到的荧光分子的重心,subdiffraction 有限公司定位的单分子是否可行且精度为 1 nm。

 

图 1: 视场图像的微管蛋白表达 YFP                                                图 2: YFP,微管蛋白 TIRF 图像侵彻深度: 120 毫米


  

图 3: YFP,微管蛋白 TIRF 图像侵彻深度: 90 毫米                                    图 4: YFP,微管蛋白 TIRF 图像侵彻深度: 70 毫米


另一大 TIRF 显微镜领域是应用的如囊泡膜融合过程的考试。倏逝波只激发荧光靠近细胞膜,正,可能要监视吞囊泡的形成和分泌囊泡与质膜的融合。为此目的,可以通过标记胞货物蛋白质的荧光蛋白质,像绿色荧光蛋白标记囊泡。

由于光学切片,它有可能以解释荧光强度作为荧光标记囊泡运动进入或离开倏逝场或作为货物释放或吸收的变化。在强度相当缓慢的增益将意味着运动到倏逝场,因而对细胞膜的议案。后的分泌囊泡与细胞膜融合,荧光信号迅速减小,当货物被释放到细胞外空间。反之亦然,可以通过使用荧光底物观测细胞内吞作用喜欢标记的葡聚糖,被吞过程中的单元格。

另一个重要的过程发生在细胞膜是细胞信号(如信号的 G 蛋白偶联受体)。这里如招聘或运动中信号级联放大的单分子 (例如 G 蛋白) 是可以观察的。

 

图 5: 视场图像的 Galectin3 表达 YFP                                  图 6: TIRF 形象的 Galectin3 YFP


所有图像: 礼貌的教授、 博士 R.雅各、 大学马尔堡、 临床生物学部和细胞病理学,马尔堡,德国