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奥林巴斯显微镜测试目标强度扫描

2015-01-04  发布者:admin 

光学显微镜的光学性能通常通过其响应成像被用来测量对比度传递函数的高对比度周期线光栅时确定的。一个理想的测试目标(MBL-NNF)为此在海洋生物实验室在伍兹霍尔,马萨诸塞州与国家纳米制造设施在康奈尔大学合作开发的。

除了周期性的线间距,所述MBL-NNF测试目标提供单和配对线和点和一个测试西门子星(图1),它允许一个仔细分析由这些微观特征产生的一个函数的衍射图案的两个照明模式。

互动教程演示,从目前的一个平场复消色差物镜测MBL-NNF测试目标的定期线图案使强度扫描。 光栅分别以515纳米的激光波长和0.82的聚光镜的数值孔径成像的由在非共焦的传送模式的扫描激光显微镜以40倍/ 0.95 NA物镜。 强度进行平均平行于光栅线条的尺寸。 要查看强度的整个范围,将滑块移动到无论是左(较低的空间频率)或右(高空间频率)。 需要注意的是强度取决于空间频率时,作为最大的在低频和最低处的更高的频率。

输出信号的调制,光波的形成样品的图像的强度,对应于在显微镜图像对比度的形成。 因此,MTF对于特定的光学显微镜的测定可以由周期线或间隔存在于一个样品所造成的图像中的正弦强度而变化作为空间频率的函数产生的对比度而获得。 如果具有1微米(交替吸收和透明线对之间的距离)的空间周期的检体,使用浸油成像在高数值孔径(1.40)与匹配的物镜/聚光镜对,各个线对将被清楚地分辨在显微镜。 该图像将不会是一个忠实的再现线对图案的,而是会具有的深色和浅色条纹间对比度的中等程度。 降低线对之间的距离为0.5微米的空间周期(空间频率等于每毫米2000线)将进一步降低在最终图像对比度,但增加了空间周期为2微米(空间频率等于每毫米500线)将产生的图像对比度的相应增加。

当空间频率接近每毫米(空间周期等于0.2微米)5000线,采用的500纳米照射波长在高数值孔径(1.4)达到用光学显微镜的分辨率极限。 在这一点上,对比度将是几乎检测不到与图像会出现灰色的中性色调。 在真实的标本,对比度在显微镜中观察到的量取决于图像的大小,亮度和颜色,但人眼不再检测周期性在相反的水平低于约百分之三到五对紧密间隔的条纹和可能达不到分辨率的0.2微米的限制。

最终,在显微镜达到限制空间频率(截止频率),这是关系到物镜的数值孔径(NA)和照明波长(λ)由下式

截止频率(c(f)) = 2NAobj

这种关系表示,在空间频率的事实具有较大的数值孔径和更短的波长照射在显微镜的分辨率提高的方面。 光学分辨率的另一个指标, 罗利两点准则,基于所述点扩散函数的分布宽度。 两点是在检体相邻分布由光学系统分成两个单独的点扩散函数。 这些点扩散函数的分布的宽度决定的各点的接近程度可以彼此并仍然通过奥林巴斯显微镜来解决。

当使用相转移函数相结合,光学系统调制传递函数变为光学传递函数,这是点扩展函数的傅立叶变换。 傅立叶变换的一个基本属性是一个函数的分布宽度成反比其傅立叶变换的分布宽度。 考虑截止频率以上时,点扩展函数的一阶衍射环的半径(r)所讨论的数值孔径之间的关系(或艾里斑)表示由等式

r = 0.61λ/NA

很明显,r和f(c)是成反比彼此所要求的傅立叶理论。 要注意,在光学显微镜不会突然停止解决间距是小于阿贝极限是很重要的。 取而代之的是在具有增加的空间频率,往往使试样具有低固有对比度,即使当它们被隔开的距离大于所述显微镜的分辨率极限无法解决的图象对比度的逐步下降。