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奥林巴斯显微镜的对比度

2014-12-20  发布者:admin 

当成像标本在光学显微镜下,在强度和/或颜色的差别创建图像的对比度,它允许单独的特征和试样的细节变得可见。 对比度被定义为在图像和邻近的背景相对于整个背景强度之间的光强度之差。 在一般情况下,0.02(2%)的最低对比度值是需要由人眼分辨的图像和它的背景之间的区别。 对于其他检测器,如电影,视频摄像机,或光检测器(CCDCMOS器件),最小对比度往往是不同的值。 与每个检测器中,信噪比(噪声是所有的光学系统缺乏图像信息的光的)必须足够大,以连贯图像的形成方面来解释。

通过光,亮度,反射率,双折射,光散射,衍射,荧光或颜色变化的吸收,在检体产生的对比度已经在明场显微镜成像样品的典型装置。 细节的脱颖而出映衬或其他邻近的细节的能力是标本对比度的量度。 在一个简单的公式计算,对比度可以被描述为

百分对比度(C) = ((I(s) - I(b)) × 100)/I(b)

其中I(b)是背景的强度I(s)是检体的强度。 从这个等式中,显而易见的是,样品的对比度是指图像中的最高和最低强度之间的关系。 在图1中所示的曲线示出背景亮度对对比度的影响。 当背景是很暗灰色颜色(I(b)等于0.01),在图像强度的小变化会产生大的变化的对比。 通过减轻的背景有点浅灰色I(b)等于0.10),在图像亮度的微小变化提供对比一个有用的范围。 在仍然较亮的背景颜色(I(b)>0.20),图像的对比度是相对不敏感的背景强度和大的变化I(b)只产生小的增加或减少中的图像对比度。

虽然在现代显微镜发现该光学系统可以是能够以高倍率制造高清晰度的图像的,这种能力是毫无价值没有足够的对比度的图像中。 反差不是标本的固有特性,但是依赖于试样的光并耦合到其可靠地记录该图象信息用的检测器的能力的光学系统的效率的相互作用。 在显微镜的光学系统的图像对比度的控制,取决于几个因素,孔径光阑的主要设置,像差的光学系统中的程度,所使用的光学系统的对比度,检体的种类,和光学检测器。 有几个网站,在显微镜下,允许调整对比度。 这些包括字段光圈,聚光光圈,额外放大倍数为视频检测器,电子照相机伽玛,胶片伽玛,印刷纸伽玛,图像处理的实时,以及检体染色。

因为人眼感知一个目的是通过在其图像中产生的对比度,可以很容易地引入歧途除非有发生,以产生所述图像中的对比度的光的事件的知识。 图2示出了包含根据不同的对比度模式成像用光学显微镜透明,无色人类颊细胞相同的视场的3显微照片:明场,相差和霍夫曼调制对比。 这是很明显的是,三个图像出现不同,并且由于这些变化,一个显微镜可能在从各视场不同的结论。 在图2(a)中示出的细胞进行成像用显微镜在明场模式下操作与聚光镜光圈关停足以使试样边缘可见。

使用相差光学面颊细胞相同的视场示于图2(b)。 注意暗区域内和周围的物体的边缘明亮外区域,如细胞膜和细胞核(称为光晕,并且是伪影)。 在此视图中,很难以指定的细胞的边缘和解释的图像中的暗区和亮区的原因。 该细胞也显得比较平淡。 最后,在图2(c)所示的单元使用霍夫曼调制对比,其中图像的一侧是暗,而其相对侧是明亮的,导致伪三维物体的感知进行成像。 在图2中的每个视场提供了不同的试样的图像,并导致不同的解释,这只能通过了解如何在显微镜中创建这些图像被破译。

对于许多标本在光学显微镜,尤其是未染色或生活材料,对比是如此的差,试样基本保持隐形不顾物镜的解决或明确分开细节的能力。 通常情况下,为这样的标本,而不是通过杀死或用化学染料或固定剂,以改变它们是重要的。 这必然导致显微镜进行实验对比度增强技术对超过一百年,以试图提高检体的能见度和带来更详细的图像,而不改变试样本身。 它是一种常见的做法,以减少低于推荐大小聚光镜光圈或降低台下聚光镜增加标本的对比。 不幸的是,虽然这些演习确实会增加对比度,他们也严重降低分辨率和清晰度。

奥林巴斯显微镜要考虑的是如何光和物质讨论控制在光学显微镜下的对比度的方法之前,进行交互的特性是有用的。 负责照亮试样的光可以是空间相干的,非相干或部分相干的。 例如,光束可以成形在狭缝或环形的形式,和选定波长垂直于传播方向或在由于偏振单一方向振动在所有方向上可组成。

一些样品被认为振幅对象 ,因为它们吸收光部分地或完全地,并且因此可以使用传统的明场显微术可以容易地观察到。 别人认为是自然色的或人工染色化学染料的颜色也可以清晰地成像的显微镜。 这些污渍或自然的色彩吸收白光穿过的某些部分和透射或反射其他颜色。 通常情况下,污渍相结合,产生对比的颜色,如蓝色苏木染色的细胞核结合粉色曙红的细胞质中。 它是利用污渍标本不容易吸收光线,从而使这些图像肉眼可见的普遍做法。

其它试样不吸收光并且被称为相位对象 。 因为人的眼睛只能检测强度和颜色的差异,由于对象的相位变化必须被转换成强度的差异。 相位标本的特征在于由若干标准,包括它们的形状(通常为圆形或平的),内部光散射元件,厚度的密度,以及独特的化学或电的结构特性(共同分组为折射率)。 厚的样品可以是比较明确的,并且仅包含几个光散射元件,或者它们可以包含许多散射元件没有通过光,使检体有效地不透明的透射照明。 这些标本通常被称为反射光的标本。

当考虑光的方法,以提高检体的对比度,考虑能够被操纵以创建的那些特征的强度变化,使它们可见的试样的各种特性是有用的。 一个主要的问题是该对象的特征下了一套独特的情况下,将被改造成一个不同的强度。

样品的细节和边缘具有一个大小接近的成像光的波长将衍射或散射光,只要是在试样和其周围介质(环绕)之间的折射率的差。 折射率被定义为速度的比值通过空气或真空通过对象除以光速的点亮。 因为光通过的任何材料的速度小于光在真空中的速度,折射率总是超过1.0标本检查用显微镜的值。 为了解决物体之间的小的距离,并以再现它们的形状与合理的保真度,衍射光的大角度必须由显微镜物镜捕获。

由物镜聚集衍射(或偏离)光必须进入一个锐聚焦在图像平面中,以产生样品的细节,如示于图3.在该图像平面上,光波包括衍射光发生干涉以衍射光。 光的干扰之后的能见度非常依赖于光照射样品的一致性,与能见度通过增加一致性比例增加。 在光学显微镜下,聚光镜孔径光阑开口尺寸控制的光撞击在试样上的空间相干性。 减小光阑开口尺寸产生更大的空间相干性。奥林巴斯显微镜

显微镜长期以来依靠降低聚光镜光圈开口尺寸增加阶段标本颗粒和边缘的知名度。 对比度为振幅对象也可以由聚光光圈的适当的调整提高。 不管它们是否属于一个幅度或相位标本的小物件,边和颗粒将衍射光。 仅此衍射光的一部分被由物镜(见图3)由于物镜的数值孔径限制捕获。 未收集剩余的衍射光表示丢失的图像信息。 正确设置聚光镜光圈开口尺寸为增强标本图像对比度和引进衍射文物之间的权衡。 这些表现在分辨率,衍射环的叠加,以及其他不期望的光学效应从区域中不在共同焦点试样始发的损失。 作为衍射极限被接近,图像的对比度变低为目的的信息变得越来越小,空间频率变大。

井上和弹簧所描述的图像对比度的比值标本对比度和在由实际和理想正弦图像时作为空间频率的函数作图的光学传递函数(OTF)占据的位置的相移。 的情况下的光的来自试样的分布变得正弦,光学传递函数的模量变得调制传递函数(MTF)。 作为空间频率的增加,调制传递函数减小和标本的对比度降低。

对于每一个物镜,具体的调制传递函数是依赖于物镜的设计和数值孔径,对比度生成,照射光的波长的模式,和台下聚光镜的数值孔径。 物镜后侧焦点面的边缘作为一个低通滤波器,用于衍射光,它必须被聚焦在图像平面为干扰发生并形成颗粒或边缘的图像。 聚焦显微镜带来这些衍射光波一起在中间像平面。 的光的波前相对于所述检体的角度决定的难度在侧重于光滑圆形表面,其通常含有无衍射部位的顶部或底部的程度。然而,球形标本或纤维的边缘容易集中,因为边缘接口是在足够的角向波前和衍射的光。

当讨论相位标本,我们将定义一个对象作为检体的任何解析部。 如示于图4。在该图中的许多对象将是平的或板状,该对象具有一厚度(t)和折射率,N(S)。 周围介质的折射率为n(m)

光行进通过与光路的检体,OP = t(n(s))并通过与光路周围的媒体,OP = t(n(m)) 光程差(OPD)可以表示为

OPD = (tn(s) - tn(m)) = t(n(s) - n(m))

与相位差之中

δ = (2π/λ)(OPD)

其中π是一个常数(3.14159265),λ是光照射在试样的波长。 的光程差是两个方面的产品:厚度(t)和在折射率(n)之差。 所述OPD常常可以相当大,即使对象物的厚度是相当薄的。 另一方面,当检体和周围介质的折射率是相等的,所述OPD是零,即使试样的厚度是非常大的。 在这种情况下,光通过对象行进仅仅延迟(相位差),相对于通过所述环绕的相等厚度的光。 相位差都不能检测由人的眼睛。

相差显微镜被设计为采取的检体,并在周围的培养基中的对象之间的相位差的优势。 然而,它不是简单的相位差是必要的,但也从试样的衍射必须发生在相差显微镜工作。

相位物体的最常见的形状是连续变化的光路或密度,如示于图5。在此情况下的半球形标本1,相位物体的侧面可以用数学近似通过棱镜的形状,如下面所讨论。 相位物体的图5中的折射率为n(s)和该周围介质中n(m) 在形状自由基几何转变为相位物体只发生在边缘AB(见图5的(a))。 入射光撞击物体垂直于平面AB,而平面波阵面是平行于AB。

1的边界(图5中的圆形相位物体的顶点(a))的基本上平行于入射的波前,而在边界A和 B是垂直的。24是由一个相切的相位对象(图5(b))的圆形表面所限定的微型棱镜。 在“棱镜”角度较小,在区域2比在区域4,它是相对的区域4'。 在边缘A和 B的衍射是最强的。

因而,弯曲的对象是由许多棱镜和对象的相对侧都定向在相反方向的棱镜。 最陡的棱镜是在球形物体的赤道,而棱镜用最少的斜率分别位于顶部和底部。 这些微型棱镜形成光学梯度

OG(光学梯度= Φ = α(n(s) - n(m))

其中α是切线相对于所述平面波前 的角度。 注意,光学梯度是两个方面的产品:该光通过边之间的角度(α),并且在折射率的差n(s) - n(m))。 光穿过棱镜由角Φ(见图5(c)和图5(d))的变化方向。 在方向上的变化可能是大的,即使在斜坡或边界梯度可以是小的,如果在折射率的差较大。 如果折射率是相同的,所述光波通过无折射的相位物体通过。 光射出的棱镜的方向是依赖于相位物体(n(s))和其周围介质之间的折射率的相对差n(m);参见图5(c)和图5(d))。

正如我们前面所讨论的,圆形的相位物体连续变化的光学梯度,并且每个单独的光学梯度“棱镜”创建的光偏转的角度不同。 图5(c)示出了偏转的方向,当周围介质的折射率比相位物体更大n(m) > n(s)),和图5(d)示出的方向时,情况正好相反(n(m) < n(s))。 偏转,Φ,所述的角度是成正比的切线角度(α)和折射率差(n(s) - n(m)),使得

tan Φ = tan α (n(s) - n(m))

对于小角度

Φ = α (n(s) - n(m))以弧度表示)

总结光学梯度的边界,其中的“棱镜”的效果时,相位物体的折射率大于周围介质的是,该对象的每个斜坡上大小相等的梯度偏转以相同的角度。 此偏转角依赖于相对折射率差和几何切线角度(α)。 当介质n(m)的折射率大于所述对象n(s)的折射率,偏转距离时,情况正好相反的对面。 当没有梯度,有灯的无偏转穿过。

光可以与样品通过各种机制进行交互以产生图像对比度。 这些包括反射从表面,吸收,折射,偏振,荧光和衍射。 相反,也可以通过照相或数字电子技术增加了在显微镜的光学元件和照明模式的物理改性以及操纵最终图像。 下面的讨论突出了检体和光之间的各种相互作用和回顾一些已开发,以提高检体的对比光学显微技术。

当入射的光线照射不透明表面,它被反射的方式,是专用于该表面的地形。 非常光滑的表面反射的光以一定的角度等于该入射光,被称为镜面反射一个机制。 不平或漫反射表面往往反映光在所有可能的角度由这种现象被称为漫反射 ,导致光进入物镜的量减少。 对比度在反射光显微术可通过仔细试样制备得到增强。 金相样品往往蚀刻反应液体和气体,以揭示晶粒边界和/或抛光,以增加光量反射到显微镜。 渍,在荧光染料,薄膜,和金属涂层的形式,也可用于引入在反射光显微镜标本的对比度。 双折射标本可利用偏振光的反射光,透明的相位对象通常观察使用诸如反射微分干涉对比,暗场照明,和霍夫曼调制对比技术受试者进行成像。

人眼对在检体的振幅和波长的差异非常敏感。 出于这个原因,许多标本切成非常薄的切片(范围从1-30微米厚),并用化学染料,以增加对比度和居住标本内的结构之间进行区分。 这种技术已经相当普遍用于生物标本数百年。 染料选择性地从一个或几个波长吸收光线,并通过或反射所有其他波长的光。 一个例子是蓝色染料,吸收所有可见光波长除蓝色,这是从反射并通过检体发送。 的生物试样的内部结构元件通常染色与染料以选择性染色这些元素的混合物,增加对材料的背景下,或者是透明的或染色的不同的颜色的对比。

这些技术也适用于荧光染料,其可用于增加标本对比度具有特异性的程度高。 当荧光试样刺激的可见光或近紫外光一个波长,它们经常发光的波长较长,从而成为可见或对比相对在现场或背景(图6)的其他对象。 技术中的荧光显微镜进行了详细的显微镜底漆的另一部分进行讨论。

染色标本的对比度增加的早期和目前使用的方法是利用色彩对比滤光片,雷登涂漆明胶平方(自Kodak),或干涉滤光器中的光路。 例如,如果检体染色用红色污点,绿色过滤器会变暗红色区域从而增加对比度。 另一方面,绿色过滤器将减轻任何绿色染区。 彩色滤光片是非常有价值的辅助工具标本的对比,尤其是当黑白显微摄影是物镜。 绿色过滤器用于消色差物镜,这是球的绿灯纠正,并相差物镜,这是专为操作波长假设使用绿色光的利用尤其重要,因为相标本通常是透明的,缺乏内在的颜色。

各向异性材料通常表现出两个或更多的折射率,并因此被称为双折射,或双重折射。 其中包括在这一类中的样品是矿物质,晶体(其表现出的结构对称性的高度),纤维,毛发,和其它生物标本。 当光进入一个非光学(轴比光轴除外)的各向异性晶体的轴,它被折射成两个射线每个极化与取向成直角彼此其振动方向,并以不同的速度行进。 所得的光波被极化,并且可以干扰时,在显微镜分析器重新组合以产生被高度着色并含显著量的对比双折射标本的图像。

活标本和其他阶段的对象,这往往产生于明照明观察较差的图像,是由光下相差,霍夫曼调制对比度和微分干涉对比照明观察,而不是化学意味着清晰可见。 这些技术需要在显微镜特殊的光学元件,但通常会产生足够的对比度的图像,以显示有关标本结构的重要细节。 这些对比度增强技术的更深入的讨论可以在我们可以找到专门的显微技术部分。

另一种简单的技术用于对比度改进涉及一安装介质具有折射率从该检体的显着不同的选择。 例如,硅藻可安装在各种对比增强介质,诸如空气或商用介质苏合香的。 在折射率差提高了这些无色物体的对比度,并呈现他们的轮廓和标记更为明显。 以下部分描述了许多用于当今的显微镜,以提高标本的对比更复杂的技术。

对比度增强技术
标本 
类型
成像 
技术
透射光
透明标本 
相对象 
细菌,精子, 
在玻璃容器中的细胞, 
原生动物,螨,纤维等
相衬 
微分干涉对比(DIC)的 
霍夫曼调制对比 
斜照明
光散射对象 
硅藻,纤维,毛发, 
淡水微生物, 
放射虫,等等。
莱因照明 
暗场照明 
相衬和DIC 
光折射标本 
胶体悬浮液 
粉和矿物质 
液体
相衬 
分散染色 
DIC
幅度标本 
染色组织 
当然彩色标本 
头发和纤维 
昆虫和海藻
明照明
荧光标本 
在组织培养细胞 
荧光染料染色切片 
涂片和价差
荧光照明
双折射标本 
矿物薄切片 
液晶 
熔化和再结晶化学品 
毛发和纤维 
骨骼和羽毛
偏光照明
反射光
镜面(反射)表面 
薄膜,反射镜 
抛光金相试样 
集成电路
明照明 
相衬,DIC 
暗场照明
弥漫性(无反射)表面 
薄,厚膜 
岩石和矿物 
毛发,纤维和骨 
昆虫
明照明 
相衬,DIC 
暗场照明
振幅表面特征 
染色纤维 
漫金属标本 
复合材料 
聚合物
明照明 
暗场照明
双折射标本 
矿物薄切片 
毛发和纤维 
骨骼和羽毛 
单晶 
拉伸膜
偏光照明
荧光标本 
安装电池 
荧光染料染色切片 
涂片和价差
荧光照明
表1

表1列出所选择的对比度增强技术(S),适用于各种标本和材料进行了研究与两个发射和反射光显微镜的摘要。 该表可被用作粗略的指导,以接近在光学显微镜特定成像问题。