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徕卡显微镜重新重组玉米抗体

2014-12-18  发布者:admin 

种子提供用于生产重组蛋白质和它们的许多优点的一个有用的和多功能平台已经经常讨论。其中种子,谷类作物提供了额外的优势,如高收益和良好的配合建立的农业基础设施,可以方便地上下缩放响应需求。另外,谷类胚乳自然适于蛋白质积累,有酚醛树脂,生物碱和草酸,这是众所周知的干扰蛋白提取和下游加工的一个相对简单的种子蛋白质组和低含量。玉米的谷类作物中最高全年粮食产量和它的内核尺寸比其它谷物更大,因为胚乳组成的种子82%。玉米转化是公配合建立和几个充分表征胚乳especific和种子限制启动子系统可用于转基因表达的控制。值得注意的是,第一个商用来自植物的重组蛋白(抗生物素蛋白和β葡萄糖苷酸酶)是由ProdiGene基因公司(学院站,TX,USA)生产的玉米和纤维二糖水解,酶用来从生产生物燃料植物生物量,已经表达了对玉米种子总可溶性蛋白(TSP)的高达30%的产率。


定的优点。如上所述,玉米是有利的谷物作为用于大规模生产抗体,如在病毒中和抗体2G12已经在玉米的种子已成功地生产的平台之间,达到75微克/克的产量。2G12抗体识别在人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120包膜蛋白oligomanose型聚糖,被认为是一个有希望的杀微生物剂。

玉米种子积累无论在蛋白贮藏液泡并在蛋白质体直接从内质网衍生的蛋白质。玉米醇溶蛋白(α-,γ-和δ-玉米醇溶蛋白)聚集在蛋白质体,其包含的α-和δ型玉米醇溶蛋白的中心纤芯和γ-玉米醇溶蛋白一peripherical层。的玉米醇溶蛋白相互作用非共价地,但也交联通过分子间二硫桥,特别是γ-玉米醇溶蛋白它们是富含半胱氨酸和形成引发蛋白体的形成共价键联的多聚体的聚集体。形成二硫桥的这种能力,连同在玉米胚乳玉米醇溶蛋白的丰度(高达在成熟种子总蛋白质的50%)使得它有可能该重组蛋白如抗体的存在,这也形成分子间二硫键桥将促使低聚物的形成。抗体链共价连接于γ玉米醇溶蛋白不会被反映在2G12抗体的产率以前报道下列盐水萃取。我们建议,玉米作为可溶性重组抗体的表达平台的潜力,可以增强在玉米品种与内源性γ玉米醇溶蛋白的水平较低。

材料和方法

转基因玉米种子表达2G12携带,用来指导抗体链插入内膜系统,但没有进一步的靶向信号被固定在4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的信号肽。小片开发的转基因种子(〜1毫米3)进一步如前所述处理。通过乙醇系列脱水后,将样品渗透并包埋在LRWhite树脂和块被允许进行聚合在60℃下2天。半薄切片(1微米),得到用Leica ULTRACUT UCT和甲苯胺蓝染色,或用于免疫荧光研究。超薄切片(80纳米)也获得重组2G12抗体的免疫定位后,沾上醋酸铀1%和柠檬酸铅3%的徕卡EM AC20。光线和免疫照片拍摄用莱卡DM5500。超薄切片进行观察用FEI TECNAIģ 2型电子显微镜

结果与讨论

抗体2G12在玉米胚乳的沉积进行了研究。玉米胚乳细胞的特点是丰富的球形淀粉粒的存在,小球玉米醇溶蛋白体均匀涂抹在细胞质和一些蛋白质贮藏液泡(PSV)(图1A)内。抗体链被如PSV船(图1B)内的局部,如预期的,没有进一步的定位信息进入内膜系统中的谷物种子的蛋白质。出乎意料的是,一个强的信号可还玉米蛋白体,相反的是已被报道用于表达玉米其他分泌的重组蛋白中检测到 。

图1:2G12抗体的玉米胚乳细胞沉积。A)光镜,甲苯胺蓝。看到玉米胚乳细胞,蛋白质贮藏液泡(箭头)和玉米醇溶蛋白体(箭头)蛋白质的储物箱。B)荧光显微镜。强标记在蛋白贮藏液泡(箭头)和玉米蛋白体(箭头)内。细胞核(N),淀粉(S)。杆20微米。


在电子显微镜证实了这一沉积,此外,结果表明,部分玉米蛋白体已失去它们的典型球形外观和玉米醇溶蛋白与蛋白体的正常分布(图2)。借贷和拉金斯中描述的玉米蛋白体作为球形结构与α-和δ型玉米醇溶蛋白的低electrondense芯和一个薄的,高electrondenseγ-玉米醇溶蛋白中的周边层。这种结构是保守的,它已被证明,所有玉米蛋白亚家族的存在下,平衡的相互作用是必要的,以稳定的玉米蛋白体并形成典型球形结构。在我们的样品中,该抗体的一个显著分数只能在还原条件下萃取,指着二硫键的抗体链和γ玉米醇溶蛋白之间形成。这种相互作用也支持的事实,即无定形的玉米蛋白体的患病率是依赖2G12的量的表达,这表明了玉米醇溶蛋白抗体低聚物的存在是负责在玉米蛋白体中观察到的畸形的。而在重组药物与内源性蛋白的某些情况下,相互作用期望针对口服递送,在其他国家,像目前的情况下,它们会影响可溶性蛋白的产率。我们建议,最小化与内源贮藏蛋白的相互作用应该是有效的策略,以提高生产玉米可溶性重组抗体。奥林巴斯显微镜

图2:在WT种子(A)玉米醇溶蛋白机构和转基因种子(B)。电镜,一般的非特异性染色。WT玉米蛋白体(ZB)为球形,并有一个低electrondense中央核心,由一薄层高electrondensity的包围。在转基因种子的一些玉米蛋白体是无定形的,并显示在周边(ZB *)不连续electrondense层。酒0.5微米。