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徕卡显微镜在透明的动物更深刻的见解

2014-11-13  发布者:admin 

透明的生物帮助我们确定空间布局和细胞和组织,尤其是神经回路可以很容易地被识别和表征的连接。徕卡显微镜净度是大家议论的焦点。VIVIANA Gradinaru,助理教授,加州技术研究所,进一步发展的方法和最近被渲染整个啮齿动物体透明度引起了轰动。在这次采访中,她对清算战略及其对现代科学的影响的进展评论。

图1:脑细胞:荧光标记的脑细胞内的一个完整的脑组织3-D可视化。通过使用这种新的全身结算及染色方法,研究人员可以使生物体的组织透明 - 让他们期待通过生物体特定的细胞已被标记或染色的组织(来源:Bin Yang and Viviana Gradinaru) 。


你已经参与了最初的CLARITY出版卡尔戴瑟罗特。什么是您在清晰的发展中的作用?

我开始导致净度与卡尔戴瑟罗特谈话后2010年初该项目。这是在实验室中唯一的非光遗传学的项目,因此需要不同的基础设施。与此同时初步的实验,我建立一个新的建筑,也就是现在的数控程序(包括生化,外科,显微能力)的家中一个特殊的CLARITY实验室。

在开始的时候,只有Charu莱玛克里斯南,研究助理和实验室经理,我的工作项目。但它需要高度跨学科的技能。所以,卡尔期待通过他的博士后申请者找人化学工程专业知识(尤其是水凝胶,这是我们认为可以用来支持清组织),并发现申请人他的实验室谁想要工作在干细胞和光遗传学项目,但谁也有化学工程专业。这是Kwanghun涌佐治亚理工学院,谁加入了我们作为一个博士后,大约一年后到项目中。和Logan Grosenick,例如加入了我们的专业成像,硬件和软件明智的。Kwanghun然后执行它作为第一代净度的驱动力。

通过引入水凝胶拿出摆在首位清算组织的想法是怎样?

最初我们想使神经网络耐用UND删除元素分心观察。因此,我们旨在指导神经元建立一个内骨骼,例如通过表达角蛋白或甲壳素,应该稳定细胞结构的大脑已经被取出后。需要支持的水凝胶。水凝胶包埋的两个想法并为特定的神经元回路的更简单的可视化去除元件已经在主专利和描述了利用卡尔戴瑟罗特箱。在那个时候,我们认为器官结构使用低渗休克,内切酶消化,热等的消化远离目标内骨骼结构。我们认为,更多的立体支持,应通过任何合适的基质,如胶原蛋白,树脂或水凝胶的支持。在我们的工作中,我们注意到,该水凝胶本身,这结束了丙烯酰胺,是足以稳定组织结构和更好(更深)的可见性可以通过除去脂类而得到。

你有没有注意到影响CLARITY会对科学在那个时候?

是。想想对线虫,或斑马鱼的所有研究,认为可以很容易地识别基因突变及其对器官发育和存活的后果:之前我们已经学到了很多,从自然透明的生物。有些这样的工作被认可了诺贝尔文学奖于2002年。不幸的是,翻翻哺乳动物组织是不是同样一件容易的事,由于光散射血脂是目前全厚组织,包括细胞膜,使机关不透明。

  • 图2:肾细胞:荧光标记的肾细胞内的一个完整的肾组织3-D可视化。通过使用这种新的全身结算及染色方法,研究人员可以使生物体的组织透明 - 让他们看看通过一个有机体已经标记或染色的特定细胞的组织((Yang等,2014)。信用:细胞,Bin Yang and Viviana Gradinaru)。

能否请您介绍的进步协定,净度呢?什么是克服挑战?

PACT 仅被动净度,以调整,使该水凝胶的孔大,以加快被动脂质去除和增加抗体的穿透。我们试图清除组织,而无需使用一个电场,它原来的方法使用的,但在挑战来实现,并可能损坏组织。

你是如何开发RIMS?

我们最初的论文中使用FocusClear。然而,许多实验室努力实现方法是担心缺乏可用性和成本。我们开发的轮辋(折射率匹配液),使我们和其他人的工作更容易和经济实惠的。RIMS是一种经济实惠的替代FocusClear,研究人员可以在实验室中,也可以不破坏荧光用来存储样本数月。这是说,我们的样品也给了很好的效果,当在一个简单的山梨醇溶液(我们称之为成像sRIMS我们给在纸上的配方为好)。

如何全身结算所PARS工作?

在小区目前的报告是建立在CLARITY方法来实现整个成年机体清除和染色。这是可能的,因为本征循环系统(例如脉管系统)可以用于实现结算而不是洗涤剂和标签的被动扩散,这将是大的器官或整个生物体过于缓慢的实现。这是PARS方法,简称P erfusion辅助一个绅士ř elease在S ITU。

啮齿动物的血管路由用于介绍和分发所需的解决方案:固色剂,洗涤缓冲液,水凝胶的解决方案和SDS清洁剂和缓冲剂。甚至抗体染色,通过心脏灌注完成。对大脑和脊髓的结算,我们建议颅内灌注进入脑脊液路线(PARS-CSF)。整个过程可以在2个星期的时间最大可以实现。大部分器官在几天内清楚。并且这种方法也可应用到其它生物 - 例如人尸体 - 虽然成像和数据分析可成为随卷调查的瓶颈。

什么是克服主要挑战是什么?

还有我们不得不照顾三个主要问题:保护组织的完整性,其中包括防止器官变形和精细的轴突或表位的损害,达到最低蛋白质和核酸的损失和保留,在适用时,内源性荧光 - 所有这些,同时还清理组织比被动的结算将允许更快。虽然透明度,映入眼帘的是结算的一个粗略指标 - 完全透明组织是不是主要目标,因为overclearing也可以发生在组织的完整性成本。我们清除了足够的样本来检测的分子标记物,包括RNA转录的单分子分辨率。

这些是什么新颖的光学结算方法给出科学的可能性?其中新的应用领域,你的未来看到了什么?

一个透明的全生物体是特别有用的映射在其靶器官的整个身体内的分布和外周神经的分子身份; 这样的神经然后可以与光遗传学在疾病的动物模型调制理解什么需要调谐,以改善症状和所得到的知识,可以促进依赖于,例如更好的疗法,电刺激神经更好器官功能或用于减少慢性疼痛。虽然这是很难预测的研究将如何迅速进步,达到临床试验阶段,有大量的动力和积极性。制药公司越来越热衷于创造光遗传学的单位,我们也有在PARS结算,这甚至可以在人体组织中使用的兴趣。我们谁是从谁死阿尔茨海默病或痴呆的患者使用的净度(PACT)在人脑组织中被动形式合作者。我们还表明,它的工作原理,从一个人的皮肤癌患者检测癌细胞的活组织检查。希望通过组织与细胞和蛋白质的分辨率可以让我们对病理进展很大 - 这是迈向更好的治疗方法的第一步。

你的主要研究重点是光遗传学。如何做光学结算和光遗传学结合起来?

PARS补充光遗传学的,因为它可以揭示光遗传学操作的电路全效果,也有助于在需要调谐在疾病映射新颖电路。

在光遗传学,我们修改了啮齿动物大脑的神经元,使他们响应和光诱导的模式生物在一定的行为。当你闪耀一盏灯,在神经元激发。当你把它关掉,神经元停止射击。我们希望从光遗传学,详细了解大脑是如何的功能。研究大脑的动物模型功能,如鼠类,增加了我们人类的大脑是如何工作的理解 - 而且,有了它,我们设计出更好的治疗脑相关疾病的能力。

一个主要的挑战是确定其显示处理后的治疗效果的电路。我们没有穿过大脑连接的详细地图。这可能是一个问题,因为我们的脑深部刺激现有光遗传学研究表明。这电脑深部电刺激可能会从根本上采取行动,通过脑白质远离电极部位突出了需要更好的大脑地图。然而,难以创造这样的地图为束状整个大脑运行良好时,轴突做到这一点的常用方法是切片的组织中纸一样薄的薄片,再成像各一台,并与图像处理软件把它全部背起来:它是缓慢的,乏味的,昂贵的且易于出错。清除组织使我们能够可视化和鉴定细胞成分和它们的无切片分子的身份。

该视频显示在不同深度的逐步的横截面图像在整个荧光标记的完整肠组织。在这些图像中,血管被标记为绿色,细胞被标记为红色,并且细胞核被标记为蓝色。使用PARS技术图像拍摄(来源:杨斌和VIVIANA Gradinaru)。