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徕卡显微镜在鼠耳真皮的荧光免疫

2014-11-05  发布者:admin 

炎症和重塑过程的活体成像一直是一个重要的研究领域,并还激发了创造表达的荧光蛋白转基因无数记者小鼠模型。我们的论文描述了一种新的体内成像技术,它的设计是基于使用免疫染色对外科手术暴露的小鼠真皮活细胞和组织结构,而不会引起有害的免疫毒性作用的创新概念。在外科手术过程本身是安全的真皮脉管,因为它仅依赖于两个皮肤层在耳朵被独立地支配,通过血液中自主供给和由分离淋巴环流排出分离。


结果 

迄今为止,免疫染色在活组织中通常不使用,由于形成免疫复合物,导致高背景染色和免疫毒性。我们克服由预阻断的组织巨噬细胞的Fc受体结合,从而“致盲”这些细胞对随后的间接强免疫染色这些大的问题。由于该标记是细胞外,我们控制强的光毒性和漂白通过组织中的天然抗氧化剂浸泡,抗坏血酸(图1)。

图1:真皮活体染色和实时成像,可以Fcγ受体阻断和抑制光毒性后。 (a)该耳的小后部区域首先接触(虚线框),染色Lyve1并与第二抗体进行检测。接着,将整个耳朵被曝光后,阻止不相关的免疫复合物进行15分钟,并探讨了如前。顶部边界:无Fcγ受体阻断,从一级和二级抗体之间形成并结合Fcγ受体对组织居民免疫细胞的免疫复合物高的背景效果。底部小图:该背景主要是去与预先阻挡Fcγ受体的。 (二)光漂白最小化通过添加抗坏血酸,抗氧化剂,以林格氏缓冲该成像期间沐浴的耳组织。组织染色用抗IV型胶原蛋白和链霉亲和的Alexa647(红色)生物素化的抗体,然后不断地成像为300秒中任一未改性林格氏缓冲液(上图)或抗坏血酸盐林格氏(下图);证明光漂白的程度,对像素强度值的亮的25%显示为绿色(“高”)。需要注意的是抗坏血酸的保护效果可低估作为单个曝光时间为林格(对照)为227毫秒,而曝光时间为抗坏血酸是427秒。 (三)荧光衰减的定量随时间(以林格氏对5%的抗坏血酸林格氏30%),归一化到初始荧光,平均为3摄像视场;标准误差示由虚线和P<0.0001两线之间。比例尺中,200微米; B,50微米。


我们还通过染色对基底膜的标记,如实施的方法,所述组织微环境与血液和淋巴管,周细胞,神经,肌肉和脂肪细胞的特定成像IV型胶原,而不是从非结构性纤维胶原成像的二次谐波信号,基底膜蛋白。我们提出的实验装置的详细的设计和细节进行成像的一系列重要的生理活动超过12小时,包括血液和淋巴管之间白细胞运输。我们还实现这种技术用于成像肿瘤细胞浸润和转移,以及免疫细胞归巢至肿瘤(未示出)。这些事件可以成像与同时记录当地的生理参数,如血管通透性和淋巴引流。活体免疫重要的还可以外趋化因子的商店与细胞迁移的事件相关联。 


因为耳真皮几乎是二维的,我们可以很容易地收集,而不是更慢和更昂贵的共聚焦或多光子显微镜用荧光立体显微镜(图2)这样的数据,。在徕卡荧光立体显微镜主要光学嵌入显微镜支架,这会导致从16到320倍线性放大率内。在该系统中,透镜的主要功能是在同一时间使透镜的工作距离是相对大的,收集的光的最大量(对于2X透镜它为2cm的工作距离)。这与全自动化相结合的阶段,导致操纵和成像通常允许一个以上的耳朵在一次实验成像的舒适度。


图2:在手术暴露耳朵背真皮血液循环的功能。 (一,二)明视场图像,显示血液循环(一)手术后立即(二)20分钟,在相同的耳,其中,循环中的所有主要血管出现完全恢复之后。 (三)Lyve1染色(在不同的耳朵)示出了淋巴管的网络,其中,所述耳部的前部不能与宽视场徕卡显微镜成像由于皮下组织的下层脂肪组织。 (四)TRITC葡聚糖通过淋巴管引流功能。 TRITC葡聚糖是在被染为IV型胶原的背部皮肤的顶皮内注射。血管中的露出真皮(e)条的功能作为可视化与血管内TRITC葡聚糖(红色)表示损坏的血管(箭头),该泄漏葡聚糖进入间隙空间。 (六)血管通透性的静脉后,IV型胶原染色耳组织评估注射155 kDa的TRITC葡聚糖。 (六)泄漏用30分钟(Ctrl键;顶部)的基础水平和在加入1μg/ ml的VEGF-A的(底部)后的同一组织中。 (克)的荧光强度,在血管外空间中作为时间的函数,表示血管渗漏的量化相对增加。示出的是平均值(三角形和正方形)和10的摄像视场的标准误差(虚线)。 P <0.0001两线之间。以下图片来自同一实验(由分号隔开):图。 1a和1b;图。 1C;图。1D;图。 1E;图。 1F。比例尺中的a,b,和c2毫米; D,F,100微米;即,500微米。


在我们的出版物中,我们比较我们的技术,先进设备,最先进的活体成像的各个领域的标准。因此,我们观察到前面描述的血管外渗和各类白细胞的免疫细胞进入收集,而不是初始的淋巴管的独特的可视化淋巴血管内的事件。我们还发现从原位移植黑素瘤转移细胞迁移的主要模式(未示出)。我们表明,在体内,CCL21是能够形成于收集,但只有很少的初始淋巴强,不连续的沉积。这是耐人寻味的,因为收集容器有最新的被忽略,因为免疫细胞进入潜在门户网站。事实上,我们发现,皮肤树突细胞和粒细胞能进入收集淋巴管,观察,不仅增加了位于集热器的不连续的CCL21补丁的发现生理重要性,但它也可能在淋巴和CCL21的生物学切换模式作为血管内到这种类型的船只都未曾观测到。多么重要的发现可能是事实,非常类似我们的,但补充的观察以及初始淋巴管弱,连续CCL21趋触性梯度最近发表在科学韦伯等人。我们的纸补的Weber等人的研究,因为我们提供了一种可能的解释为对相比,收集那些初始淋巴强CCL21的沉积物相对不频繁的定位。我们怀疑淋巴集热器具有丰富的串珠素的存在和集聚蛋白的蜱基底膜,通过淋巴源性CCL21遇到的第一个组织受体,是在捕获肝素 - 结合的趋化因子相比,由基底膜弱支持初始淋巴管(图更好3)。

图3:现场染色只检测外基底膜结合CCL21,而固定的组织染色上揭示了细胞内和细胞外CCL21。 (A-B)在活耳真皮CCL21在补丁(箭头),并沿连续淋巴节段(箭头)积累,和共定位用(一)串珠素和(b)IV型胶原,收集淋巴的两个基底膜成分船只。 (三)偶尔观察到CCL21阳性(绿色)初始淋巴管(ILY)染色更弱为IV型胶原蛋白(红色)。 (四)外CCL21存款(绿色)看到周围的露耳的皮肤淋巴管没有与血管损伤相关领域,如通过静脉确定TRITC葡聚糖(青色)可见,从受伤的血管(箭头)组织染色的串珠素和CCL21后的区域泄漏。比例尺中的a,b和d(左),400微米; c和d(右),100微米的。


讨论 

这种方法应该是有趣的和有用的科学界,特别是在微循环,免疫学和肿瘤微环境,包括对肿瘤的血管生成和抗血管生成治疗的研究领域。它具有一些优于其它活体成像技术:(ⅰ)活体荧光成像已经被用于在微循环研究,例如,从血液或淋巴管进入跟踪溶质渗漏,但还没有被结合的免疫染色。 (ⅱ)利用遗传修饰的报告小鼠的允许为特定的细胞类型,以进行成像,但要求它们的可用性(或大量的努力,以生成新的),并限制了可研究相互作用的细胞类型的数量。 (ⅲ)细胞外基质可以被成像在利用二次谐波生成的体内,但是这仅仅限于纤维状胶原,留下大量的像基膜,纤连蛋白或生长因子和趋化因子结合的糖胺聚糖够不着对当前研究的重要基质。我们的方法克服了所有的这些限制,并进一步允许引入标准的成像技术以及进一步与免疫染色为其他类型的细胞,组织结构,趋化因子的存款,或胞外基质蛋白,而同时跟踪血液或淋巴流。最后,这种方法受到重视它出版之前。该图像示出黑素瘤细胞侵入淋巴活集电极船只被选择作为自然综述文章的封面图像“跟踪转移和欺骗癌症”。 


总之,这活免疫桥接实时,生理功能与在皮肤复杂的细胞事件的分子成像本地测量。此外,这种方法具有更大的潜力,因为它可以很容易地应用到如研究了血液和淋巴血管生成后的发育机制,移植排斥反应的实时成像,或通过各种致病体可视化的皮肤感染的早期阶段。例如,我们正在整理,其中通过使用这种活法,我们确定了线虫感染和进入淋巴管机制的手稿。我们也分析了在转移和血管生成的肿瘤的细胞外基质的异质性的效果。凭借其灵活性和高通量的潜力这活技术,可以彻底改变生物学的多个领域。