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奥林巴斯显微镜过滤器的彩色摄影

2014-11-02  发布者:admin 

通过显微镜拍摄由宽幅意想不到的颜色变化和改变,这会影响该图像的胶片乳剂或数字电子图像拍摄设备呈现的光谱复杂化。 这些意想不到的摄像结果由多个因素,从所述光源和所述膜乳化光学工件,例如象差和灯电压的波动之间不正确的颜色的平衡造成的。

如果膜乳剂和显微镜光源之间的色温差异已被仔细地控制,如在我们的讨论中描述的色温 ,那么小的调整显微镜光源的色彩平衡通常能够减少色移的问题。 在大多数情况下,对于不希望的色彩效果的原因是很清楚的,或者可以很容易地通过仔细研究根据该已曝过光的条件决定。 在其他情况下,该问题是不能立即明显,并且可能需要进行详细调查的原因没有被覆盖之前。

的彩色摄影的问题的基础上已经被确定之后,它通常是很容易纠正与适当使用的一种或另一种过滤器。 过滤器用于选择性地阻止或减少选定波长的强度,同时发送的所有其它部分。 各种过滤器是可商购的协助显微摄影中,以获得最高质量的图像可以补偿光学和照明的问题。 许多显微摄影的色移或石膏可以通过插入适当的柯达雷登色彩补偿滤波器插入光路径进行固化。 其他的过滤器,如中性密度,对比度增强,紫外线吸收,热吸收,红外,并设计成协助将出生物污渍的细节过滤器也经常使用。 这些过滤器将在下面详细讨论。

过滤器是在玻璃的形式通常可用的,已涂,混合,或浸渍有从天然和合成来源获得的有机和无机染料的塑料膜的玻璃,乙酸盐,明胶或碱。 玻璃或聚合物中的过滤器的制造中使用的质量是很重要的,并且应该是光学级,并提供密度和颜色的均匀性,在整个显微镜视场。 明胶过滤器是最符合成本效益和良好的光学过滤器可以买到,这使得过滤器的关键显微摄影的首选材料,尽管所需的柔和处理。 光学玻璃过滤器也是极好的,但这些都不是可用的,以满足所有的显微镜的需要。 醋酸滤波器通常用在非图像形成系统,其中所述需要的质量和精度是不重要的。 通常,乙酸过滤器用于在照相放大机和打印机。 塑料涂层的过滤器,主要用于在暗室安全灯的应用,并且不适合用于光学显微镜。 使用由不同制造商的术语可以是混乱的,因为过滤器是由产品号或通过其过滤性能的某些方面通常称为。 很少有全行业的过滤器的命名标准。

色彩补偿滤镜 -柯达公司生产的雷登系列专为广泛的实验室和工业应用的光谱色彩补偿滤镜。 这些过滤器包括用适合的染料混合并分散在明胶中以达到所需的光谱特性的胶态碳。 色彩补偿滤波器从色彩平衡和转换过滤器的区别在于它们通过减弱主要是可见光光谱的红色,绿色和/或蓝色的区域控制颜色。 它们被简化为前缀的CC,对于C鼻天鹅Çompensating,接着由滤波器的标称峰值密度范围从约0.025到0.5乘以100,并与过滤器的颜色的大写首字母(例如M代表品红色)结束。 因此,具有0.3的额定峰值电流密度的缩写,黄色色彩补偿滤镜是:CC30Y。

在此系列中的每个过滤器控制的单一颜色的同时使1其余两种颜色的或两者的量。 在这种方式中,颜色补偿过滤器可以使细微改变光源的颜色平衡,也可以补偿在光谱输出的不足。 对于一个系列的蓝色色彩补偿滤波器(CC025B通过CC50B)的可见吸收光谱示于图2中的主要最小值出现在范围380-490纳米的为在此系列中的所有过滤器,其通过最蓝的波长和过滤绿,黄和红色的波长时置于奥林巴斯显微镜的光路中。

色彩补偿滤波器被标有号码(标称峰值浓度),以指示其吸收光的能力。 最常用的浓度是05,10,20,30,40,和50,其递增地增加滤光器的光密度从较小(05)更大的(50)的密度。 作为一个例子,一个30号过滤器降低了它的补色的50%,或1曝光步骤的水平。 一个CC30M滤波器(品红色)吸收绿色光线通过它的50%。 色彩补偿过滤器可以组合使用(例如,CC20Y(黄色)+ CC20M(品红)= CC20R(红色)),但为了取得最好的效果,应该只用一个单一的过滤器。 当两个过滤器相结合时,创建一个稍微不同的颜色,这可以掩盖颜色缺陷的显微照片的假象。

一主用途颜色补偿滤波器是克服从批内或不同批次之间的变化在胶片的乳剂。 色膜的制造是一个复杂的过程,涉及涂敷无数感光乳剂是只有几微米厚的聚合物基体。 在乳剂厚度波动会影响色彩平衡,并且可以显示在一个或多个单独的显微照片,在薄膜的整个辊子,或在一个批次中的一部分。 厂家允许的变动公差相当于一个CC10滤波器,已被证明是可接受的大多数用户的变化的效果。

临界显微摄影决定了可用于小心控制的色移,这可能在的6原色的任一项变化颜色补偿滤波器:红色,绿色,蓝色,青色,品红色和黄色。 大多数情况下,观察背景颜色上的新的显微照片,当膜批次变化是第一显而易见。 这种颜色应该是一个中性的浅灰色或白色,而颜色的变化通常发生时非常明显。 它是一个简单的事情,通过使用互补色移存在于背景中的过滤器来校正色彩补偿滤光片的色彩平衡。 当使用彩色胶片承担了沉重的负荷显微摄影,这是明智的购买电影有每卷相同的乳液号和多余的储存在冰箱或冰柜。 测试辊然后可用于确定色彩补偿和平衡的变量,应保持恒定的膜批次的其余部分。 推荐的步骤是让没有补偿滤波器的单个帧,然后通过每个CC10系列过滤器(CC10R,CC10G,CC10B,CC10C,CC10M和CC10Y)曝光帧。 在5000κ轻表,它显示一个干净的白色或非常浅灰色背景的背景对准所有7的显微照片之后是已经被正确地过滤所述一个。

在图3中所示的显微照片显示出使用人下十二指肠组织的曙红/苏木精染色的薄截面的显微照片的彩色校正过滤器测试。 如图3(d)示出了在不添加色彩校正滤光片基线色彩平衡。 整体偏黄的图像显示,一个CC10G滤波器(图3(f))的是适当的过滤器进行色彩校正。 实际上,在图3中的背景(f)为图3中的所有图像的最清洁和最纯净,并且表示用于颜色校正的最佳选择。 其他过滤器(图3(A,C,E,F,G))产生的背景,在显微照片让人联想到的补偿滤波器的色彩。 在光路中放置一个CC10Y过滤器(如图3(b)),不仅增加了黄色背景的强度。

在许多情况下,低密度颜色补偿过滤器可以有效地用来提高在组织薄切片被染色的各种染料的彩色再现。 每个样品必须在试验和错误的基础进行评价,由于色彩补偿滤波器的过度使用可能导致的互补色斑的颜色劣化和可能使用色调的背景。 一般最好限制在尝试使用它们来提高色斑的颜色时颜色补偿过滤器的密度低于CC20。

所建议的约翰·G·德伊 ,也有以柯达雷登过滤器更便宜的替代品用于显微镜的预算,或者当这些过滤器不可用。 柯达也生产包含一组具有0.10,0.20,和0.40的每一个的6种颜色(红色,绿色,蓝色,青色,品红,黄色)的光密度值的透明滤光器的彩色打印可视过滤器套件 。 这些过滤器可以放置在显微镜的光端口上,以提供一个快速简便的颜色校正。 虽然不制造成相同的临界公差为雷登或彩色印刷的过滤器中,观察过滤器通常可以被取代的,如果它们没有在表面上严重污点。 柯达还提供了一组醋酸彩印滤光片( 彩色打印过滤器集),这是在75×75毫米正方形提供,并且包含足够的过滤器来匹配由雷登过滤器提供最密度。

使用下面的链接导航到包含数据的个人色彩补偿滤镜规格页面:

  • 色彩补偿滤色片数据 -可见吸收光谱和含有主极大的波长的表提供了用于柯达雷登系列颜色补偿滤色片家族。

中性密度滤镜 -当显微镜照明太亮了舒适的观察和显微摄影的情况下,光照强度应通过使用中性密度滤光片,通常被称为ND滤镜减少。 这些过滤器是中性灰色颜色和设计是均匀地减小的透射光强度跨部分或整个波长范围,而不会引入在色温的显著变化。 中性密度过滤器是理想的,用于控制彩色显微照片,曝光时间,而调整灯电压。 在光学显微镜的主要用途就是延长曝光时间的情况下,灯的强度是如此之大,由摄影设备所允许的最短曝光超过正确地捕捉图像所必需的时间。

有两种类型的中性密度过滤器:吸收和反射的,其通过吸收或反射波长的选择的频带工作。 图4所示是用于一系列共同的中性密度滤光片的可见光吸收光谱。 如可以被看到的,在图中,这些过滤器显示在整个可见(400至700纳米)的光的范围的相对恒定的消光系数。 每个中性密度滤光器增量从ND-0.3至ND-70在图4中有一个连续的较大消光系数,它们共同用于调节照明提供均匀的一系列过滤器。

中性密度过滤器使用已经浸渍或溶解的材料,以减少光学透明度明胶,聚合物或玻璃基板制成。 柯达雷登中性密度滤镜是非常受欢迎的,而且都是用专用的明胶薄膜。 含有有机染料的选定补体的胶体碳悬浮液中混合液体的明胶,直到所需的中性密度。 然后这个组合涂覆到支撑玻璃基板上,直到它形成一个非常薄的均匀厚度的膜。 干燥后,将膜从基板剥离,并涂有清漆以保护。 请注意,即使中性密度,颜色补偿,以及其他雷登过滤器由一个漆涂层的保护,但它们仍然suseptible损坏(特别是从划痕),并应在边缘处或在弯道中仅处理。 另一种方法是通过将其放置在一个简单的金属框架,还销售柯达保护明胶雷登过滤器。 切勿将过滤器暴露在温度超过50摄氏度长时间。 同样重要的是,这些过滤器不能放在过于靠近显微镜,以避免损坏的卤钨灯光源由于由该灯所产生的热量。

规格为最常用的中性密度过滤器示于表1。每个中性密度滤光器是由字母数字代码,ND-XX,其中XX是平均透射光的百分比由过滤器指定。 因此,使用ND-60过滤器发送(或传送)60%的来自光源和一个ND-0.1过滤入射光的透射入射光的0.1%左右。 中性密度滤光片的光密度根据以下方程定义为吸光度(透射率的倒数)的对数(以10为底):

光密度 (D) = log(A)

在哪里:

A(吸光度)或不透明度= 1/T (透光率)

和,因此:

D =log(1/T)

其中T是光的百分比正在透过过滤器,D是光密度,A为吸光度。 大多数显微镜参考密度,而不是不透明度(透射率倒数)与中性密度过滤器时。 这可能是更合适的,因为人眼感知对数标度的光强度的差别。

中性密度滤光片可以堆叠在一起,以实现对其中不存在过滤器的密度值。 堆叠这些过滤器是附加的,使得把一个ND-50(密度= 0.3),并和ND-60(密度= 0.2)过滤到光路径相当于一个ND-30(密度= 0.5)过滤器的这种放置。 以0.30的密度的过滤器具有50%的(ND-50,表1)的透射率,因此,它可以用来通过两个因素来减少显微镜灯的强度。 同样地,具有0.6的密度滤光器(ND-25,表1),具有25%的透射率值(减少了四倍灯强度),和密度1.0(ND-2.0,表1)的一个过滤器可以以10(10%透光率的值)的系数降低灯光强度。

如前面所提到的,调整曝光在显微摄影中是的主要目的为使用中性密度滤光片之一。 许多现代的显微镜都配有液晶屏幕显示的通知的曝光时间操作的快门速度可达百分之一秒的曝光监测。 这些显示器通常也允许在1/3到1/2档光圈的增量调整曝光。 在一些情况下,使用具有高能量卤钨灯明照明时,特别推荐的显示器的曝光时间小于0.05秒。 这是一个非常短的时间,这会导致图像的曝光和渐晕不足。 加入ND-50中性密度滤光器的光路将必要的曝光时间增加一倍至0.1秒,而一个ND-25过滤器会增加曝光到一个舒适的0.2秒。

中性密度滤光片规格
称号密度传输 
(百分比)
ND-800.180%
ND-700.1570%
ND-600.260%
ND-500.350%
ND-400.440%
ND-300.530%
ND-250.625%
ND-200.720%
ND-160.816%
ND-130.913%
ND-101.010%
ND-12.01%
ND-0.13.00.1%
ND-0.0140.01%
表1

调整曝光用中性密度过滤器的能力,对于具有固定的快门速度的摄像机尤其重要(这些速度范围为约1/500秒至几秒),其中每个连续的速度增加曝光由一个双重的增量。 例如,曝光表可建议为一个快门,其具有最大的速度有限,以1/250秒的1/1000秒的快门速度。 通过将ND-25中性密度滤光器在光路中,灯的强度被有效地通过四个因素减少,增加建议的曝光时间1/250秒。 实现更加舒适的快门速度,使用ND-2.0过滤器,以提高曝光时间0.1秒。

中性密度滤镜也可用于横亘2快门速度的曝光是有用的。 在一个情况下的1/125秒的快门速度是太短了,但1/60秒太长,中性密度过滤器可以被放置在光路中,调整照明容纳在这两个值之间的曝光。 甲ND-60,ND-70,或ND-80过滤器一起使用的1/125秒的快门速度将增加1/3到的f-停止于曝光时间的2/3,使得在曝光更宽容度。 的实际曝光,必须通过反复试验来确定的,但中性密度滤光片应常规用于调节曝光时间上的固定快门速度的相机。 要小心,不要通过使用中性密度滤镜介绍很长时间曝光,因为这可能会导致互易律失效和相关的色彩平衡假象。

较旧的中性密度过滤器可以获取微黄色调随着年龄的增长,以及一些较便宜的过滤器也具有一定程度的背景颜色。 如果引进的中性密度滤光片在光学通路导致不正确的色彩平衡的显微镜,经过精心校准,使用色彩补偿滤镜显微镜光源返回到其适当的平衡。 其它光学因素,如内部散射和反射,可影响中性密度滤光片的有效密度,导致它们从测量的密度而变化。 出于这个原因,它以校准中性密度滤光片临界显微摄影是重要的。

过滤器被弄脏试样 -生物组织的薄切片进行染色,通常用一种或多种有机染料,以选择性地增强的标本中存在的各种特征的可见性。 强度和大多数生物组织产生的污渍将重现很好的彩色胶片的色调,但有些污渍往往会显得模糊或有自己的颜色转变,尤其是在多个染色的混合物。 在许多情况下,颜色补偿过滤器可以帮助恢复大部分或全部丢失的颜色,但过多的过滤可能会影响相邻的染色特征和背景的颜色。 出现此问题的与流行的污渍曙红,品红和亚甲基蓝,这是不复制在大部份的彩色胶片。 通常,组织染色,这些染料,它们可以单独或以混合物出现浑浊和缺乏色彩饱和度。

为了抵消这种效果,显微镜采用钕镨过滤器 ,它含有溶解在玻璃稀土元素的组合。 钕镨混合物过滤除去一部分可见光谱的桔黄色区域的,一个效果,即增加在试样棕色,蓝色和红色染色的特征的色彩饱和度的强度。消光系数是最高的580和590纳米的钕镨过滤器之间,从而使过滤器,以除去大部分的橙色和黄色的颜色往往暗红色和蓝色调的染色薄切片。

如图5中所示两种显微照片同一试样,薄沾上曙红和苏木精的混合物人胰腺的部分。 在左侧的显微照片(图5的(a))是在没有颜色补偿滤波器的益处或钕镨混合物过滤。 在右侧(如图5(b))是相同的视场的图像时,此时用插入到光路中的钕镨混合物过滤。 注意在颜色饱和度,在此显微照片,红色和蓝色色调的急剧增加。

钕镨混合物过滤产生于非常薄的玻璃部分的厚度一至两毫米的,因为光线被过滤器所吸收的量取决于过滤器的厚度。 较厚的镨钕过滤器可以引入文物,如彩色背景和其他污渍的颜色退化。 大多数主要的显微镜制造商提供适当的尺寸作为选购附件的镨钕过滤器。

在某些情况下,生物样品的背景可以成为轻轻染色过程中,不希望的伪像中着色。 为了避免这种情况,彩色补偿滤波器可用于减去背景颜色,只要不是过饱和。 与染色薄切片的另一个问题是在安装介质的着色。 加拿大香脂,一个流行的用于制备薄切片中,通常会变成淡黄色随着年龄的增长或整装标本。 一个蓝色的色彩补偿滤镜(CC10-20B)通常会解决这个问题,除非该标本是一本很厚整装。 在这种情况下,有可能无法完全中和的黄色色调。

紫外线过滤器 -卤钨灯显微镜不发射一个显著量的紫外线,但有些除了汞和氙气灯的较新的卤钨灯产生在300-400纳米范围内的一个相当大的量的紫外线。 紫外线辐射可露出感蓝乳剂层中的许多彩色膜,导致整体的显微照片,有一个偏蓝。 这主要是用荧光显微镜中的问题,但它可以通过使用高强度的钨 - 卤素,汞或氙灯发生在任何显微镜。 为减少紫外线照射,使用柯达雷登2B2E过滤器,吸收低于390和415纳米的紫外线辐射,分别。 该2B过滤器将删除几乎所有的紫外线的波长,只留下可见光照射试样。 具有阻断的波长较大的频谱时,2E滤波器也会除去一些紫色和波长较短的蓝色光,因此该过滤器是不理想的彩色显微摄影。

紫外线对彩色摄影的影响示于图6的图像的左侧(图6的(a))示出了曙红 - 苏木在人结肠上皮细胞染色的粘液分泌的管状腺薄膜部。 有一个整体偏蓝到弥漫大多数样品的特征和背景的显微照片。 放置一个柯达雷登2B滤光镜插入显微镜光路中后,在右侧的图像(如图6(b))得到。 请注意,此显微照片显示出更好的色彩饱和度和消除偏蓝的清洁背景。

闪光灯管也可产生一个相当大的量的紫外线,并且可能需要使用一个滤波器,以去除不想要的波长。 许多现代的透明薄膜的颜色进行日光照明平衡含有吸收紫外线的掩膜作为薄膜层中的一个。 在这种情况下,使用的过滤器可能是没有必要的。 它是读取在每一个新的电影类型制造商的规格表,以确定是否它是通过紫外线光阻挡层保护的一个好主意。

热吸收器 -几乎90%的钨或钨-卤灯发射的辐射发生在红外波长的形式,这是与生产相关联的热。 汞和氙弧灯也产生了相当多的热量。 吸热过滤器可以被添加到所述显微镜的光路附近的照明器,以除去不需要的红外波长和保护显微镜的光学部件,过滤器,并从热损伤试样。 事实上,大多数主要的显微镜制造商提供吸热过滤器作为标准配置,有的甚至将这些过滤器进入照明。 如果你怀疑你的显微镜照明可能有一个内置的吸热过滤器,请查阅使用手册或联系您的乐器经销商。 许多OEM照明散热过滤器不能轻易拆除,应留在原地。

一些吸热滤光器从硼硅玻璃的一种特殊类型称为Aklo,其吸收红外线的热射线,并且是绿色或蓝绿色的颜色制成。 与Aklo制成的过滤器可能会引入色彩平衡偏差为显微照片。 此副作用可以用颜色补偿过滤器,互补的吸热滤光器的颜色进行校正。 如果热过滤器可以从灯壳被除去,这样做并检查它在5500κ轻表。 浅绿色的热量过滤器可以通过一个CC10M或CC20M品红颜色补偿滤波器来补偿,而蓝绿色的热量过滤器可以通过一个淡红色(CC10R或CC20R)滤波器来补偿。 将互补的过滤器上的热量过滤器的顶部,直到发现了正好平衡在热过滤器中的色调和曲折的颜色中性。 当插入显微镜光路中,该补偿滤波器应减轻色彩平衡问题。 一些较新的显微镜有二色性干涉滤光片设计,以反映热退入灯箱。 二向色滤光片,远远地阻挡热比石英或玻璃吸热过滤更有效,并且不会产生裂纹或断裂时,一个显著量的热被吸收。

为了利用在彩色摄影滤波器的全部潜力,在显微镜必须具有的过滤器,可见光,和胶片的乳剂间的相互作用的技术方面的完整的理解。 当过滤器被正确地用于解决色移和平衡问题的彩色显微照片的质量有很大的提高。