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尼康显微镜色差和光晕环相差伪像

2014-10-21  发布者:admin 

两个在相位对比图像观察到的非常常见的效果与特征色差和光晕圈图形,其中所观察到的强度并不直接对应于检体和周围介质之间的光程差(折射率和厚度的值)。这种互动式的教程演示正负相差显微镜色差的文物。

本教程以初始化出现在半透明的蓝色矩形试样在窗口的左侧。相邻的标本是一个模拟相衬视场(有权理想人格形象,直至色差滑块翻译)描述如何样的姿态出现在理想的无伪影的情况下,在尼康显微镜。在窗口的右手侧是横跨沿着x轴试样的中心所取的线强度的扫描曲线图。该扫描显示了相对于所述背景样品的强度分布。

为了操作的教程,使用鼠标光标移动到翻译色差度滑块到右边,这将增加该神器的严重性。作为色差截止值增加,在色差图像窗口中的试验片的外观被改变,以反映改变的标本图像。增加色差和光晕工件的水平再分配强度在试样的中心,并产生周围光晕。同时,该线强度的扫描信息被改变,以与改变的标本图像对应。标本的对比,可以进行正相衬,负相衬的单选按钮之间进行切换逆转。

虽然色差和光晕型态发生的相位相反的光学系统的自然结果,它们通常被称为相位伪影或图像失真。在所有形式的正相位相反,明亮的相光晕通常包围大样本的特征和介质之间的界限。相同的光环似乎比负相衬光学系统的样本颜色较深。这些效果是由光程差的波动,它可以变成明亮的暗光晕正相衬,明亮负相衬暗光晕进一步加剧。

光晕圈出现在相差显微镜下,因为位于物镜相板的环形相位延迟(和中性密度)环也发送一个小的程度衍射光从检体(它不局限于仅通过环绕波)。该问题是由以下事实的零阶环绕的波阵面投影到相板由聚光环带的宽度比所述相位差板环的实际宽度小复杂。在相位环和环绕的波阵面之间的宽度之差,通常是大约25%至40%,但是必要的,因为限制和光学设计的要求。因为在物镜衍射面的相位环的空间位置,只有那些对应于由样品衍射的低空间频率的波前穿过相板的环状空间。因此,通过相位板衍射试样波保持90度(四分之一波长)进行相对相位的零阶(undeviated或环绕)的光。所得到的相位相反光晕工件是由于衰减的通过一个非常小的角度相对于该零阶环绕的波阵面的衍射由样品中的低空间频率信息。实际上,不存在由样品和undeviated光波衍射低空间频率的波阵面之间的相消干涉的产生一局部对比度反转(由光晕表现)周围的检体。为了创建该图像的锐利边缘,所有的试样衍射的空间频率,必须在最终图像来表示。

相衬光晕特别突出和显着四周大,低空间频率的物体,如细胞核,硅藻和整个细胞。另一个因素为光晕工件是光能量在图像平面上的重新分布,从地区,它是破坏地区,它是建设性的。大,高对比度光晕可以为试样产生大的光程差,如红细胞,霉菌,原生动物,酵母细胞和细菌产生混乱的图像。另一方面,光晕效果往往强调试样和其周围的背景之间的对比度差异,并能提高在许多样品的薄边和边界的信息的可视性。这种效应是负相位相反,从而产生周围的低频图像细节的暗晕特别有帮助。在许多情况下,它能够减少相移和衍射的程度,导致周围的样品降低光晕的大小。最简单的补救用于除去或减轻光晕的强度是修改具有较高折射率的成分,如甘油,甘露糖醇,葡聚糖,或血清白蛋白的观测介质的折射率。在某些情况下,改变介质的折射率甚至可以产生反转图像对比度,把暗标本设有明亮而不显著干扰背景强度。

光晕环效应可通过利用包含周围的物镜后孔附近的相位环材料中性密度材料制成的小环专门设计阶段物镜来显著降低。这些物镜被称为切趾相衬的物镜,使具有大的相位差来观看和拍照,清晰度和细节的定义阶段对象的结构。在大多数情况下,细胞内的功能(如核仁)可以明确识别为具有与已切趾的物镜暗的对比度,但这些相同的特征,具有明亮的光晕或者被成像为使用常规的相位对比光学亮点。与切趾光学对比度由于衍射光相对于直射光穿过样品的大振幅扭转。 

在实践中,光晕减少和增加样品的对比度和变迹的光学系统可通过位于邻近于在后焦面内置到物镜的相位板的相位膜的选择性振幅滤波器的使用来实现。这些振幅滤波器由施加到相位膜周围的相位板的中性密度过滤器的薄膜。在古典相位板的相位偏移环的透射率约为25%,而对周围的切趾板的相移圈相邻的环的具有中性密度以50%的透射率。相位膜的两个板的宽度是相同的。这些值与相移施加到标准板在相衬显微镜的薄膜的透射率的值是一致的。


光晕在相差显微镜另一个很常见的光学神器,而且往往是在大,延长阶段,标本最容易变化。它通常会被预期具有横跨直径恒定的光程长度大的相位标本的图像会出现均匀的暗或亮的显微镜。不幸的是,通过相差显微镜产生的图像的亮度不总是承受由试样产生的光程差一个简单的线性关系。其它因素,如吸收的相位板和相位延迟或提前量,以及相位环和聚光环形带的相对的重叠大小也起着至关重要的作用。一个大的,厚度均匀的正相位对比试样的强度分布往往逐渐从边缘到中心,其中所述光强度的中心区域可以接近其周围介质的增加(相反的是真正的负相位标本)。这种效应被称为色差,并检查扩展平面标本,如材料板(玻璃或云母),复制品时经常观察到,扁平组织培养细胞和大细胞器。 

光环和正反两方面的相衬色差文物的影响列于图1为具有矩形几何形状,比周围介质的折射率高一个假想的延长阶段,样品(图1(a))。通过样品的中心区域记录的强度分布示于图1(b)所示。在正相位对比(图1(c))中,样品的图像显示出鲜明亮丽光晕和演示了戏剧性的色差效应,这是由逐渐增加的强度从边缘到该试样的中心区域遍历时表现出来(见强度分布在图1(d))。光环和色差效应已扭转负相位对比(图1(e)和1(f))的强度。甲暗晕围绕标本图像与负相位对比光学器件(图1(e))的观察时,与从明亮的树荫断过渡范围的边缘,以更暗的灰度级中的中心。此外,该强度分布(图1(f))的是从与正相位对比观察扭转。 

色差现象通常也称为区--的动作的效果,因为具有均匀的厚度,在试样中部区域衍射光不同于高折射区域,在边缘和边界。在检体的中央区域,这两个相对量和衍射光的角度时相比,边缘被显着地减少。因为衍射的波阵面从中央试样区域始发具有从零阶非偏斜环绕的波前只有边际的空间偏差(但仍然滞后于相位由四分之一波长),它们是由在物镜后方的相位板捕获焦平面,伴随着环绕的光。其结果是,中央检体区域的强度基本保持相同的背景的。色光降效应在相对平坦的平面试样的区域的外观,连同由边和边界产生的过高的对比度提供了强有力的证据表明,相位相反的机制主要是由衍射和散射的组合现象的控制。 

光晕和色差工件取决于两者的几何和光学相位板的特性和被检查的样品。特别是,相环的宽度和透射率控制这些效果发挥关键作用(相位环的宽度通常是大约十分之一的物镜的总开口面积)。为减少透光率更广泛的相位环往往会产生更高强度的光环和色差关闭,而环径对效果的影响较小。对于一个特定的阶段物镜(或正或负)时,光程差和样品尺寸,形状和结构有光晕和色差效应的严重性显著影响。此外,这些效果是由物镜放大倍数的严重影响,以生产更好的图像放大倍数较低。