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尼康显微镜平衡电弧放电光源激发照明

2014-10-07  发布者:admin 

  微调的荧光显微镜的激发光谱成像双或多标记的标本可以用分滤波器容易实现 激发平衡器 ,其中包含串联shortpass和长通干扰,转换的照明光圈调整弧放电灯的波长分布轮廓滤波器。 这种互动教程探讨尼康Eclipse I系列激发平衡器系统影响的荧光发射强度的多标记样品时,采用双重和三重激发带滤波器的组合结合。

本教程以初始化出现在样品图像窗口中随机选择双重或三重荧光标记的样本图像。临近这个窗口是一个频谱图题为激发通带光谱图,其中显示了用于染色的标本以及在照明光圈激励均衡滤波器组合的近似传输率(白线)的荧光团的吸收光谱(见激发平衡器图)在可见光谱区。在荧光探针和它们的目标被确定为每个试样中的教程窗口的左下部旁边的一个彩色条,与在该激发通带曲线的激发光谱曲线的颜色相一致。图表上的个别光谱曲线可被打开或关闭使用适当的荧光团的复选框。新的标本可以被加载到使用选择的样本下拉菜单教程。 

为了操作的教程,使用光圈位置滑块转移激发平衡器(在激发平衡器说明在本教程的右下角部分图)的长通和shortpass地区之间的显微镜光圈。当滑块被转换为最左边的孔移动到平衡器与激发通带变化的shortpass区域类似于一个shortpass过滤器的信息。检体的图像也变化,以反映荧光强度的来自具有在较长波长区域发射光谱探针的损失。移动滑块到最右边移动光圈到长通区域,并产生了激发通带图形和标本图像的相应变化。在这两个极端之间的是混合区域的激发通带类似的两个截止滤光片的混合(如做标本的图像)。 

尼康显微镜Eclipse i系列荧光照明器励磁平衡系统使显微镜使用具有双重或三重激发滤光片组合的光块时微调激发波长频带的照明光圈最大的效率。此功能是有用的,以在包含多个探针,例如,减少从一个探针的荧光发射,同时增加以优化观测和数字图像的记录的另一个的强度试样调整单个荧光强度。标本染色,具有两个或更多的荧光团通常表现出不相等的荧光发射强度值,由于多种因素,其中包括不相等的量子产率,overstaining或understaining,膜的渗透性不足,阻挡差,定影剂掩蔽的抗体结合位点,低固有抗原的浓度,并简单的荧光团和第二抗体混合的错误。激发平衡器可以帮助减轻这些标本的荧光信号的不平衡。

尼康激发平衡器由一个包含两个薄膜干涉涂层的作用,可以是长通或shortpass过滤器(或两者的混合物),这取决于在该光具组的窗口的位置的长方形状的光学玻璃窗口,如图教程和图1中的矩形过滤器被安装在位于相邻的显微镜照明孔径光阑,它被包含在一个可移动的壳体,插入到显微镜落射荧光照明器(称为数字成像头在尼康的滑块Eclipse的i系列显微镜)的视场光阑的光学路径的前面。的光通过激发平衡器和激发照明的数值孔径的量可以通过调节孔径光阑的大小来控制。当观察overstained标本,过度荧光发射通常可以使用在与中性密度滤光片组合和由收缩孔径光圈大小的激发平衡器降低。 

如图1中所示是长通(黄色曲线)和shortpass(紫色曲线)激发平衡器滤光片的光谱曲线,连同三个荧光团(DAPI,FITC和德克萨斯红)相匹配的滤波器的特性的归一化吸收光谱组合。在实践中,尼康激励均衡滤波器组合滑块是由拉或推的帧处理,从而暴露的激发光不同的楔形截止滤光片的混合物被翻译过的照明光圈。当滑块定位,使得该照明光圈与激发平衡器(紫色曲线下面积)的shortpass部重合,仅通过来自照明用下面520纳米的区域的吸收光谱曲线荧光团会被激发到一个显著度电弧放电灯。当滑块移动到激发平衡器窗口的相对端,所述长通的薄膜过滤器部(黄色曲线下的面积)是由孔径照射,以激发具有波长大于430纳米的荧光探针。需要注意的是荧光团,如FITC和Alexa Fluor488,具有在蓝色光谱区(450-500纳米)的激发带被激发以高度的效率,无论激磁平衡器位置的。 

当在显微镜的照明孔径被定位在包含两个长通和shortpass过滤器的部分“混合”的区域中,激发效率而变化为具有在紫外吸收带和可见光谱的黄绿色区域的荧光团。如在该照明光圈前面的拉头的一部分由含有专门的shortpass干涉滤光器成含有两个滤波器的比例相等的区域的区域被翻译的,吸收紫外线的荧光团的吸收效率为约100%至50%持续下降。同时,吸收绿光的荧光团的吸收效率稳步增加,从零到50%,而该吸收蓝光的荧光基团保持不变。当滑块运动持续到含有较大的长通滤波器的比例地区出现了相反的效果。在这种情况下,吸收紫外线的荧光团的吸收效率下降,从50%到零的吸收绿光的荧光基团的增加,从50%的效率为100%。再次,激发在蓝色区域的荧光团的吸收效率保持恒定。

各种常见的荧光团,包括Alexa的荧光染料,酞菁染料(在CYX系列),BODIPYs,荧光蛋白,MitoTrackers,SYTOX核酸污渍和许多传统的合成和天然探头可以组合使用的激励与均衡在双迎刃而解或三重激发滤片集。例如,在一系列的图像,如图2中说明沾上的Alexa Fluor405(微管),SYTOX绿色(核)和德克萨斯红(丝状肌动蛋白网络)瑞士白化小鼠胚胎细胞单层培养和成像用DAPI -FITC得克萨斯红三重过滤组合使用激励平衡器。在图2(a)中,激发平衡器滑块位于与shortpass薄膜滤波区域中的照射孔径的前面,以优先激发的紫光和蓝光的荧光团(的Alexa Fluor405和SYTOX绿)。平移滑块进入激发平衡器(含有两个滤波器的比例相等)的中心区域产生含有来自所有3的荧光(图2(b))的图像。最后,移动滑块到含有长通滤光片的区域(图2(c))的消除了紫色荧光团,得到由荧光团(SYTOX绿和德克萨斯红)兴奋的可见光的蓝色和黄绿色区域产生的图像光谱。代替DAPI-FITC-德克萨斯红三重激发带滤波器组合与一种设计用于DAPI,FITC和TRITC会产生类似的结果,但对于具有吸收曲线从黄绿色转变为绿色荧光优化(TRITC与德克萨斯红)的波长。

激发平衡器也非常适合分离含采用了时下流行的双带通滤波器的激励组合,如DAPI-FITC,FITC-TRITC和FITC标记的得克萨斯红两种荧光探针样品荧光发射。图3示出几个例子。图3(a)是小鼠小肠沾上核探针的Hoechst33258(蓝色荧光)和Alexa Fluor 488缀合到鬼笔环肽(绿色荧光)通过与的shortpass部分的双过滤DAPI-FITC结合成像的薄组织切片在该照明光圈前面的激发平衡器来激发两个荧光团。平移激发平衡器入长通区域(图3(b))的消除了紫外线吸收核染料(Hoechst的33258)。采用这种方式,激励均衡器是用于控制在已经overstained核标本的荧光发射非常有用。 

耦合到蓝色和绿色的双激发滤光片组合(FITC-TRITC和FITC-德克萨斯红),激发平衡器可用来控制从样品标记有荧光团的吸收在通过橙色波长范围内的绿色发光强度水平。示于图3(c)是印度麂鹿沾上的Alexa Fluor555(橙色荧光)标记的鬼笔环肽对,和Alexa Fluor488的皮肤成纤维细胞中的贴壁单层培养的图像共轭的山羊靶向抗过氧化物酶的抗小鼠抗体膜蛋白(PMP-70)的初级抗体。使用FITC-TRITC双波段激发滤光片组合设置与激发平衡器定位成使得长通薄膜滤波区域与照明孔径一致的图像被捕获。平移激发平衡器到shortpass区域(图3(d))的减少(或消除)从吸收绿光的荧光团(的Alexa Fluor555)的荧光发射。类似地,FITC-德克萨斯红滤波器产生类似的效果(图3(e)和图3(f))的。在后两个帧中的检体是标记的Alexa Fluor594缀合的鬼笔环肽(肌动蛋白)和的Cy2偶联的靶向小鼠抗-α-微管蛋白的一抗的二抗大鼠胸主动脉细胞培养物。