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徕卡显微镜冷冻断裂和腐蚀简介

2014-10-02  发布者:admin 

 冷冻断裂描述了技术打破了冷冻标本展示内部结构。 冷冻蚀刻表面冰的升华在真空下揭示破碎的脸,原本隐藏的细节。 金属/碳混合使样品在扫描电镜成像(block-face)或TEM(复制品)。 它是用来调查例如细胞细胞器,膜层和乳剂。 生物应用技术是传统,但开始在物理学和材料科学发展的意义。 最近,冻结骨折电子显微镜,特别是冻结immunolabelling复制品(FRIL),提供了新的见解的角色动态膜蛋白的细胞过程。

 

图1:在小麦蚜虫离开
 

适合环境的电子显微镜

电子显微镜的室转移到一个非常低的压力。 活细胞的结构放在这个环境不能保留由于极其快速蒸发的水使大多数细胞的一部分。

有许多生物样品的可能性做准备。 材料可以保存(固定),随后脱水产生最小破坏体内的结构,可以用环境扫描电镜或水可以冻结。 高压冷冻是唯一的方法观察水化结构在自然状态。 冰由高压冷冻不是六角冰,这显示了一个增加体积的水冰但无定形冰,体积保持不变。 因此结构敏感的渗透和温度变化是保存(请参阅文章“ 简要介绍高压冻结”)。

观察结构如细胞细胞器膜,液体乳剂或表面接口,冻结骨折是唯一的方式。 冷冻样品坏了武力的刀(或类似)或释放弹簧负载和阻力最小的路线。

图2:冻结骨折

 

升华和凝结的水——冻结腐蚀和污染

揭示断裂表面的细节,冰已经被删除。 这需要通过升华冰保存标本的结构。 冰直接转化为水蒸气不经过液态这将导致体积和结构损伤的变化。

图3:ES,Exoplasmic表面;PF,原生质的断裂脸;英孚,Exoplasmatic骨折脸;PS,原生质的断裂脸;Cyt,细胞质
 

水的升华/冷凝过程取决于在特定温度和饱和压力的有效部分水压力室中的水或冰。 注意:一个好的真空降低了部分水压力。

例如:冰或冷冻标本温度为-120°C的饱和压力约为10 mbar。 如果这种压力室设立,冷凝和蒸发平衡。 蒸发的分子的数量等于凝聚分子的数量。 在更高的压力冷凝率高于升华率-冰晶在试样表面的生长。 这可以避免。 冷(标本)板以上标本减少了当地的压力和工作作为一个凝结的陷阱。 水分子从标本优先附着在冷表面。 在压力低于饱和压力比分子升华冷凝和冷冻蚀刻。

执行冻结蚀刻,直到样品是完全无冰的,称为冷冻干燥。 这个过程只适用于小样本在合理的时间执行。 完成几个步骤通过加热在-120°C到-60°C维持每一步的温度在一定时间。 这可能需要几天。

图4:饱和蒸汽压(1982年由Umrath)
 

在试样的温度低于-120°C蚀刻率非常低,腐蚀时间增加到不切实际的时期。 如果真空室的压力是固定的,它可以增加腐蚀率提高试样的温度。 小心温度高于-90°C的生物样本。 蚀刻率极大增加。 此外六角冰形式从玻化冰,导致脱水文物。

纯水的理论升华率降低,因为:

  • 水的深度标本升华物低于水的表面。
  • 溶剂盐和大分子减少升华速度。
  • 相当一部分的束缚水的生物样品升华率较低。

冷冻断裂生成图像

冷冻断裂和冷冻蚀刻技术需要在真空条件下沉积在裂缝表面极薄重金属和碳薄膜。 


冷冻断裂的样品在用金属角后跟一个碳备份薄膜包衣(徕卡EM ACE600冻结骨折或徕卡EM BAF060与徕卡EM VCT100),以产生一个副本,以在TEM或扫描电镜块面进行成像。 


对于这两种方法有一定量的蚀刻时间以同样的方式经过该断裂面涂敷。第一薄(2-7 nm)的重金属下角涂层产生地形对比度(阴影)。第二个90°下涂布在厚的碳层(15-20纳米),以稳定的超薄金属膜。在这一点上,蚀刻过程停止。将图像的非常小的结构的重金属是在非常低的角度(2-8°)的施加和涂层过程中的样品被旋转。这增加了对比的丝状和小结构。这种技术被称为低角度的旋转阴影。 


电子束蒸发应当用于重金属膜。这是涂层技术,给人一种非常精细和定向沉积。碳的支承层稳定它们由金属露出的结构。这些结构将改变温度的升高而在其轮廓,样本不会是完全导电的,副本也不会粘在一起。

单向冻结破碎酵母的阴影

图5:左:低温扫描电镜,BSE(背散射电子)的形象。 右:复制品,TEM图像(由Electronmicroscopy苏黎世理工学院)

 

应用程序

图6:高通滤波器,徕卡EM VCT100转移到徕卡EM BAF060冷冻蚀刻和低温涂料使用电子束枪和旋转试样架。 徕卡EM VCT100转移到低温扫描电镜。 托公式在油/水基地,大约。 3分钟-100°C(升华)暴露脂质层(粗糙纹理晶片+乳化剂)。 由斯蒂芬·维斯纳博士,拜尔斯道夫,汉堡
 
图7:高通滤波器,徕卡EM VCT100转移为冷冻断裂/冷冻蚀刻和徕卡EM BAF060 cryo-coating使用电子束枪和旋转试样架。 EM VCT100转移到低温扫描电镜。 有翼的硅藻混合文化的原生生物游仆虫属。 罗兰博士的斑点,NIBSC陶工酒吧,英国 
图8:高通滤波器,冻结破碎、冷冻蚀刻和低温caoted徕卡EM BAF060 /莱卡EM VCT100过户到低温扫描电镜。 油/水乳化暴露骨折洋葱状薄片形成液滴的成分。 由斯蒂芬·维斯纳博士,拜尔斯道夫,汉堡
 
图9:酵母细胞在TEM复制品。 高压冷冻黄金标本在徕卡EM BAF060运营商和冷冻断裂。 由Elektronenmikroskopie苏黎世理工学院 
图10:Funghus大麦叶片。 安装在徕卡EM BAF060标本表通过冷却和冷冻标本表在液态氮。 徕卡EM BAF060部分冷冻乾(冷冻干燥标本温度较高)。 与钨涂层。 徕卡EM VCT100转移到低温FESEM 5凯文。