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奥林巴斯显微镜共聚焦显微镜的物镜结构

2014-09-30  发布者:admin 

  任何常规光学显微镜的配置,物镜是在确定图像的信息内容的系统中最关键的部分。 精细标本细节的对比度和分辨率,其中的信息可以被获得的样品内的深度,和图像领域的横向范围都是由物镜的、用于观测的具体条件下的性能确定的设计。 额外的要求是在共聚焦扫描技术对物镜,在这个关键的成像组件也可作为照明聚光镜和经常需要进行高精度在很宽的波长范围内和在非常低光水平,不引入不可接受的图像退化的噪声。

无论任何其他系统组件的功能,没有信息可以被添加到图像,不是最初的物镜捕获。 在成像路径一定的中间组件可以执行校正功能,但它们的主要性能要求是降低物镜受到尽可能少的基本图像信息。 传统上,一个特定的应用程序在物镜选择考虑的首要因素已经被放大,无论是干燥或浸泡的设计要求,与透镜系统的数值孔径。 新的成像技术,通过技术改进激光器驱动,荧光染料的发展,新的样品标签的能力,以及不断改进的光学显微镜的生产厂家,具有显着增强在某些研究领域的进展。 这是在细胞和分子生物学和神经科学领域尤其如此,和激光共聚焦显微镜结合荧光技术已被广泛地依赖作为一种研究工具。

图1给出了一个高性能的物镜专门设计用于在光谱的可见光和红外区的激光照明。物镜 是60X平场复消色差透镜水浸泡(平场)模型,这是波长范围从450至1100纳米的修正。 这一物镜的有用的应用程序之间的同步荧光法和微分干涉对比( DIC )无色差的可见荧光和红外DIC图像之间的观察。物镜 上也装有一个校正环,使玻璃盖的厚度和球面像差的成像时,深部组织内或通过水溶液还原波动调整。 球形和色差在400-700纳米区域的像差校正,也可用类似的物镜,如模型设计的紫外成像下降到350纳米的。 后者的物镜的几个版本(见图2)进行校正,使紫外光的激发下,蓝色发射到同一个焦点为可见光,从而实现真正的共聚焦成像的整个视场。

放置在物镜在共聚焦仪器的总体要求是类似于那些在其他关键显微镜的应用,尽管不断增长的需求的新技术所带来的更常见的比以往的方法这些透镜系统的性能极限。 某些应用程序的特定的局限性表明了其他物镜的特性可能是一样重要,甚至更重要,比那些传统上被认为是最重要的。 为了满足目前有前途的技术的基本要求,制造商已经推出了专门针对这些方法的优化性能的新型光学。 高数值孔径的发展,高度校正浸水物镜是响应于在活细胞和组织的研究急剧增加的一个例子,它是通过在含水介质中进行的必要性。 这是可能的,在激光共聚焦显微镜的具体要求,将导致光学的发展,不严格正确的一个或一个以上的分辨率影响畸变实现其他的设计物镜,聚焦性能是更重要的青睐。 通常讨论的例子是在活细胞研究的较高的光子收集效率的需要,这可能为物镜,牺牲一定的像差校正以最大限度地提高透光率发展的激励,尤其是在关键的荧光发射波长。

光学系统的分辨率是普遍接受的是两种试样的功能,使他们能够区分为最终的图像分离之间的最小距离。 在一个指定的对比度,视觉识别所需的基础定义,分辨率可以量化为一个光波长的函数( λ )和数值孔径(na )的光学系统。 之间的衍射波前干涉图像平面产生的艾里斑的光强分布,其直径( D )是由下面的公式,在理想的衍射受限系统:

dAiry = 1.22 • λ/NA

著名的瑞利准则考虑两个相同点难以辨别时,由艾里斑直径的一半分离。 因此,通风的半径( R )是等效的横向分辨率,并通过修改前面的方程定义。 当荧光被利用,物镜函数作为聚光镜和物镜,因此在下面的表达, na 代表物镜的数值孔径:

rAiry = 1.22 • λ/(2 • NA)

衍射的限制,导致强度的横向再分配从对象到通风模式也产生散焦沿着光轴,从而改变图像的点的大小和形状。 三维强度的点扩散函数描述的强度分布和代表转移标本信息的图像平面的光学系统的性能。 一系列的光学像差的透镜系统的特征,以及任何不受物镜设计或补偿由另一个光学元件校正将改变代表图像中的每个样本点的强度分布,降低相对于理想衍射性能有限的图像。 在激光共聚焦显微镜应用的潜在异常的相对重要性必须在物镜选择的技术考虑。 在物镜设计和性能的主要因素,因为它们涉及具体的共聚焦显微镜,在下面的章节中讨论。

目前,应用最广泛的生物应用共聚焦显微镜配置采用了计算机控制的扫描系统,使照明激光束聚焦,通过物镜的,在一个固定的标本。 这是被称为 离轴 激光共聚焦扫描因为扫描光束偏转的光轴的每一侧并利用物镜元件周围地区。 早期实现在光学显微镜扫描技术的应用 扫描的激光束保持固定在光轴与试样阶段或物镜进行扫描。

虽然在原则上两种扫描方法可以产生相似的结果,以选择最佳的性能物镜的要求是明显不同,在轴和离轴照明扫描,并考虑发射荧光收集的物镜也不同。 三分之一扫描式利用纺丝 尼普科夫 磁盘扫描大量的照明点在试样不移动光源或显微镜阶段。 虽然这种方法被广泛应用在半导体行业,可以允许实时反射光聚焦的观看,这是不常见的应用于生物仪器。 尼普科夫系统可能在活细胞的调查,然而变得越来越重要,因为他们的潜力,以减少细胞损伤与配置采用高强度的激光源。

透镜像差影响的物镜表现可以分为两类,包括那些非色(不变的波长),和色差,这是依赖于波长。 色差是任何 横向色差 纵向色差 ,和波长独立组包括 球形的 畸变, 昏迷 散光 场曲率 ,和 失真 色差和球面像差的影响整个图像领域,而在离轴区的残余像差更普遍。 色差和球面像差(见图3)是最有可能的聚焦性能的影响。 一般来说,色差不能被修改的程序,必须通过光学元件的设计处理。 其他文物,尤其是球差,通常是加剧了物镜的或不匹配的光学元件引入的不当使用,但可以减少或补偿后的适当的技术或与该光学系统的调整。

球面像差

球差是非的色差,是最重要的聚焦性能,是球面透镜组件,使轴和周围光线被集中在连续的平面性的一种表现。 不同程度的折射光线路径通过不同的镜头带结果中的一个点源的聚焦图像模糊,并产生一个不对称的强度变化的上方和下方焦平面。 在所有的现代物镜,校正球面像差视觉上察觉不到的水平,如果指定的操作变量为物镜的设计完全满足。 不幸的是,存在几种可能性,在实践中允许从物镜的光学设计的标准偏差,并引起球面像差。 由于球面像差只能精确规定的距离关系的物镜和标本和图像平面之间的适当修正,工件可以不经意地介绍,如果物镜指定的管长度不能维持。 这如果是用在有其他比所需的管的长度在一个有限的校正系统显微镜发生,或由光学元件引入,如过滤器,为会聚光束路径在这样一个系统。

球面像差的最佳修正需要认真注意的成像介质的物镜外,这是另一个潜在的性能退化的来源。物镜 特性是由设计和不定会适应的操作条件范围内(以校正铤提供调整除外)。 这可以增加显著的球面像差的因素是质量差的浸油的物镜和标本之间,非标准的盖玻璃的厚度,样品安装介质,和试样本身。 任何物质进入和样品之间的物镜镜头前表面的成像系统的一个重要组成部分。 在高数值孔径的坚持的物镜设计的要求变得更加重要。 玻璃盖的厚度和折射率可以提高球面像差的变化,特别是“干”(非浸泡)物镜。 高数值孔径的干燥的物镜一般是专为一个0.17-mm玻璃盖的厚度的最佳性能,具有标本直接安装在与玻璃接触。

允许的球面像差的校正时,非标准盖玻片厚度时,很多物镜都配备了可调校正环,可以设置一系列的厚度设置。 校正环通过翻译内部透镜组来改变物镜焦距。 即使一个正确的厚度盖是用玻璃,一层玻璃和试样之间的介质安装存在偏离理想的光的情况下,将增加的球面像差的程度。 校正环也可以被用来减少由这种性质的折射率变化引起的球面像差,在激光共聚焦显微镜会降低强度在针孔和深度减少歧视由于轴向焦点转移。

油浸式物镜通常是优化使用一个0.17-mm厚度在指定波长的折射率1.518的玻璃罩,和浸油的精确定义的折射率。 通过对玻璃盖和沉浸介质指定的操作条件下,球面像差可以通过波长为几个值的物镜设计校正(取决于物镜的类型)。 之间的匹配的每种材料的折射率在光路中的重要性,从试件和安装中物镜镜头前的元素,在历史上一个最棘手的成像条件,特别是在试图达到高分辨率的生物标本。 亚细胞成分的折射率是大大低于常规浸渍介质,在许多情况下,这些折射率是不确定的,改变整个试样。 即使在固定材料,安装介质折射率通常是不相同,可用浸泡油。

活细胞中的动态过程的研究,这是培养并维持生理盐水,油和水的折射指数的结果对油浸物镜性能的一个关键限制的不匹配。 主要的问题是,高数值孔径的油浸物镜的潜力是不是由于水的折射率之间的不匹配的实现(1.33),浸泡油(约1.5)。 在共聚焦显微镜的应用的一个关键因素是提高荧光成像和厚的样品的三维表示,和球面像差时引入的油浸物镜是限制水标本深度为中,可接受的图像可以得到。 在一般情况下,高数值孔径的油浸物镜是设计用来在图像平面的不超过15至20微米的玻璃盖下。 当应用于水的标本,然而,球差引起的在水玻璃盖接口可以达到相当的水平在深度为10微米。 作为一个例子,点扩散函数,如图4所示出增加的程度球差发生平场复消色差透镜油浸物镜在穿透深度范围从零到8微米。

在从水生物标本采集三维数据,利用激光共聚焦荧光显微镜技术的兴趣被厂家引进一批高数值孔径的主要诱因,高度校正浸水物镜。 球面像差是活细胞的共聚焦研究的一个主要的光学限制时的油浸物镜的影响,和成比例增加的深度观察到水性介质和可变的子细胞成分(见图4)。 对成像的负面影响包括对比度和信号强度,由于在发射的荧光强度到达探测器的针孔的分数减少损失,微小的标本特征分辨率损失,并减少 Z 轴的定位精度,从而影响的三维图像重建的完整性。 利用水浸的物镜成像时,试样在水介质中显着的深度下方的玻璃盖,球面像差的降解是可以避免或减少,使激光共聚焦技术的充分实现的好处。 能够在水介质中超过200微米的深度收集准确的三维数据具有长工作距离浸水物镜。

一个油浸物镜,无论光学矫正的程度,是不能成像水浸泡标本的最佳选择。 最佳的图像质量可能是这个组合只为在与盖玻璃直接接触标本地区。 在更大的深度,球面像差,降低对比度和分辨率和减少图像的亮度,在某种程度上,聚焦的信噪比大大降低的影响。 使用一个高度校正浸水的物镜是降低引起的球面像差成像时,在大的距离,在水介质中的最佳解决方案。 虽然设计的前透镜元件直接浸入试样中可用的物镜,重点是采集三维数据所需的变化可能产生的序列中的图像之间的试样不良的运动。 为了避免这个标本运动时物镜试样的距离是变化的,一个玻璃盖必须用在大多数情况下。

一些最近推出的高数值孔径水物镜将调整项圈提供球面像差校正的变量,如在盖玻片厚度波动引起的。 这种类型的校正环补偿在生理介质和细胞成分的折射率的差异也是有用的,和折射率随温度和溶质浓度的变化。 由于这有助于引起的球面像差的各种因素,可调节的校正是聚焦应用物镜的一种理想的功能,即使在最佳厚度的玻璃盖采用。

离轴像差

常见的光学像差简称 昏迷 主要影响的点源,远离光轴,产生条纹状的图像点的径向畸变,在视场角的严重程度增加(见图5)。 昏迷是有点类似于球面像差,可能是由同一因素引起的。 这是一般的像差校正在现代光学系统中的透镜元件的适当利用,和物镜中,昏迷和球面像差被淘汰被分类为 消球差 因为昏迷是一个离轴像差,它具有共聚焦激光扫描系统的意义,它通常利用离轴光束的路径,但不与样品扫描一个因子(轴)的共聚焦显微镜。

几何畸变的一些额外的类型可能对共焦物镜性能的显着,因为在区域的图像场远离中心的所有的都更加明显,他们更可能影响到在激光扫描共聚焦系统的性能。 共聚焦成像的光学要求是,只有高度校正光学系统有可能充分履行,和显着的几何像差通常会被最小化的物镜从这类。 然而,它是有益的,要知道这些畸变和潜在的问题,他们可能会引入时,物镜选择,尤其是如果特定的性能特点是以牺牲另一个变量的优化可能在一个特定的应用程序是更重要的。

未校正 散光 可以减少图像的清晰度和对比度,强度,增加的影响,从光轴的距离(图5)。 像散的图像点的几何形状可能考虑两个正交的平面,断面图像的波前通过定义。 飞机(切向和矢状面)在像散系统可能有不同的焦距和表现出不同的半径为完全对称的样本点。 这种畸变的结果在对称的点,位于离轴是径向或切向伸长的图像特征,根据焦点。 当最好的重点是选择在两个极端之间的一种折衷的位置,由此产生的通风盘是非对称的,导致图像退化。 散光可导致低中心的元素在一个低质量的或损坏的物镜,是显微镜的光路中增加了其他失调。

一个透镜性质描述为 场曲率 野平坦度 是在许多关键的测量和高分辨率成像应用的重大意义,例如半导体检验,虽然在大多数生物共聚焦的调查,它不是一个严重的限制。 简单球面透镜聚焦图像点来自不同地区在一个平坦的试样在弯曲图像的表面,这反映了透镜表面的形状。 平面图像平面不符合焦点曲面,其结果是该领域的中枢和外周区不能同时把焦点对准。 更复杂的透镜组成的透镜元件的设计,多个团体,是必要的正确的这场曲率和扩大的焦点中心区的大小。物镜 指定为 平场 平场 纠正光学产生从中心到边缘具有清晰度广泛的适用领域,以最小的场曲,在中间图像平面。 在最后的图像平面场的平整度也依赖于中间的光学元件,包括显微镜目镜。

现代的物镜是能够产生清晰图像领域是大约两倍,在早期的物镜的可用字段直径。 专门的抗反射涂层,使这一成就的技术创新中,虽然增加了光的复杂性降低的光传输和更大的成本。 在激光共聚焦生物应用厚截面或活细胞成像,非平场物镜的使用可能会容忍由于物镜产生的截面曲率相对微不足道的其他因素的不确定性对精确的试件形状。 如果其他光学畸变校正,在三维数据集的任何潜在的失真可以纠正轻微场曲率引起的。 在许多情况下,奈奎斯特采样条件可能只需要物镜字段的中央部分,利用。

从中心到边缘的图像场放大产生的几何非线性 失真 试件的特点,使他们真正的三维轮廓被扭曲的图像。 如果存在的话,这种作用是很容易观察到,当交叉线正交组的成像,而不是出现在整个图象场直,线可以是向外或向内弯曲的区域远离磁场中心。 这两种类型的失真通常被称为 枕形失真 失真,分别。 是场曲率的情况下,少量的几何失真通常在生物学中的应用并不是很重要的,但可在材料科学研究至关重要如果缺陷分析和精确测量的物镜是。

色差

畸变是由两个基本的光学现象,具有波长依赖性引起,产生不同类型的图像缺陷。 一种类型的色差的事实是,所有的光学玻璃的折射率随波长而引起的,而在放大率随波长变化的第二个结果。 折射率与波长的依赖关系(通常称为 色散 )产生不同波长的光的有效焦距差。 因此,对于一个由一个单一的玻璃组成的简单的镜头,只有一个波长(或一个窄的波长范围内)可以精确地聚焦在一个特别关注的背景图像平面。 其它波长的光将集中或接近或远离镜头。 由此产生的光谱色散沿着光轴被称为 纵向色差 ,或者, 轴向色差 (见图6)。 为一个点源成像的光学轴,折射率的渐变引起蓝色的光被聚焦的最近的镜头,波长较长的会聚在重点逐步远离透镜。 的像差,如不加以纠正,可以看成是不同颜色的条纹图像时失焦的最好的视觉焦点的两侧。

未校正的纵向色差在用于激光共聚焦显微镜物镜可以产生深远的影响,尤其是当成像两种或两种以上的荧光团,这取决于能力证明在几个波长的荧光共定位。 当多个荧光团,纵向色差引起的各种激光激发光束可以聚焦在样品中的不同点,和类似的结果在不同的发射波长收集非重合点。 这种畸变对建立的荧光团的准确位置的可能性 Z -在三个维度的样本数据生成的方向。

在激光扫描共聚焦技术,为一个特定的物镜色差图像的完整性的影响的评估需要的所有因素,确定穿过针孔,记录由检测器的信号能量的考虑。 这些因素包括激发激光发射谱,每个荧光团的发射峰和带宽,和探测器的光谱灵敏度。 纵向色差校正通常是由具有不同的光学特性的多个透镜元素的组合的物镜设计完成,修正为物镜,为不同的类别分类的基础部分和程度(见下文)。

透镜的焦距与波长的变化,从而产生表征纵向色差轴向扩散,同时还负责发生 横向色差 (见图6)。 由于放大率是成反比的焦距,焦距与波长的变化,产生相应的放大对波长的依赖。 如果这是不物镜像差校正,图像中的锋利的边缘,可能被包围的红色或蓝色的条纹。 从蓝色波长成分信号放大率可能会有所不同从约1的红色分量百分之2未校正的物镜。 当在一个共焦扫描光学系统,横向色差可以导致在针孔信号丢失,因为可能发出的光将拍摄地点是接近或远离光轴比真正的试样的位置,这取决于光的光谱成分。

因为这两种类型的色差是相关的,物镜是高度校正纵向色差一般表现出最小的横向色差和。 采用不同的方法通过显微镜厂家中的光学性能的影响的各种因素的校正,和系统组件的仔细匹配是获得最大校正像差本质。 共焦荧光显微镜,未校正的横向色差的结果在误差进行了映射的荧光发射不同波长的位置的纵向变化类似的问题。

大部分的光学显微镜制造历史,为物镜的设计标准后,所需的物镜在一个指定的固定距离的物镜安装表面形成一个真正的图像,对应于目镜前焦点平面。 基于物镜的真实的中间图像直接形成的结构称为 有限 系统,和距离的中间图像被称为 管长度 的物镜。 虽然在同一时间,各厂商的标准有限光学系统在同一管的长度和齐焦距离,不同的方法被用来补偿透镜的像差,而这个因素必须如果来自不同制造商的光学元件组合使用,考虑。 有限的系统可被设计为在物镜提供充分的像差校正,或一个已知的残留水平横向色差可以在物镜上形成的图像,这是由目镜补偿。

无限的 光学系统,光线离开物镜不集中,但保持平行,直到被会聚在中间图像平面的 管材 透镜(有时称为 特兰 镜头)。 最主要的显微镜制造商已经开发出无限远校正光学系统,这从物镜的光线的内在利益,聚焦于无限远处,是相对不敏感的附加的光学元件放置在“无限空间”之间的物镜和管透镜。 虽然管透镜可以执行一些残余像差校正,在设计,提供完整的校正内的物镜性的优势,与管透镜光学中性。 图7给出了典型的直立和倒置荧光显微镜无限光通路。 双头白色箭头在每个显微镜图显示物镜后孔和管透镜之间的平行光路。

不同厂家的坚持在无限系统不同的设计规范,包括管透镜的焦距长度和无限的空间。 无限远校正光学系统的物镜是使移动以代替显微镜的阶段,在观察期间,要求试样的微妙的操纵应用的一个明显的优势。 然而,在无限空间的主要实践的好处是,辅助光学元件,如偏振光分析器,过滤器,和微分干涉对比 DIC )棱镜,可以添加未经其折射性质或厚度主要关心的。 只要他们有平面平行的表面,添加元素对图像质量的影响可以忽略不计的有。 相反,光学组件不能置于有限校正系统的光路,这是收敛的物镜和中间图像平面之间,而不引入图像移位和其他像差的厚度和折射率不同的添加元素。

在显微镜的物镜的光学校正

不论一个有限或无限远校正光学系统的应用,设计了系统的物镜相结合的性能标准,必须考虑到在确定的物镜,将满足特定成像技术要求。物镜 通常分为根据其光学矫正度性能类别。 作为讨论的相对重要性,各种像差和性能指标的影响取决于他们的方式是用物镜和应用的基本要求。物镜 的最一般的分组通常是基于他们的像差校正的程度,虽然传统的物镜类别已变得不那么明显的最近,由于在光学设计和制造技术的重大进展。 大部分的描述性术语仍然是有效的和广泛使用的,和所使用的术语的理解和他们如何涉及到聚焦的应用是非常重要的当各种可用的物镜正在评估。

色差是用于制造透镜的光学玻璃由于分散,通常利用相结合的具有不同色散特性的透镜元件校正。 传统上,具有最小的校正色差的物镜分为 消色差透镜 (见图8),通常采用玻璃具有正常色散。 这种类型的眼镜具有折射率随波长的近线性下降,包括冠和火石玻璃。 冕玻璃通常具有低的折射率、低色散,在对比火石玻璃,通常具有高折射率和高色散。 中老年消色差物镜,两个或两个以上的这些类型的玻璃透镜元件相结合,提供色差校正带来了红色和蓝色的光聚焦到一点,也为绿色光的球面像差校正。 现代的消色差物镜的球面像差通常有额外的校正,和场曲的重要修正。 如果物镜是纠正延长平整场整个图像域,它是指定平场 消色差透镜 在一般情况下,消色差物镜传统的明场观察是合适的,和显微摄影和数码影像与额外的( 平场 )场曲率校正。

为了实现改进的色差校正,玻璃类型具有反常色散的光谱的一部分是必需的。 在显示的折射率与红色和蓝色光谱区域波长的非线性变化的眼镜,色差可以抵消允许多个波长的同时重点。 结晶萤石是第一个发现的材料来减少未校正二级光谱负责绿色或紫色条纹,边缘锋利的边缘提供合适的光学性能的表征,获得消色差图像。 在各种光学玻璃的组合,萤石元素提供的能力,正确的色像差的三波长(颜色)和两个球面像差。 此外,这种高度修正物镜改进传输特性在紫外线光谱区。

更近来的技术发展已经提供了新的光学玻璃配方和透镜成形产生类似萤石元件的色散特性,而大多数制造商生产线的具有光学校正接近那些最高类别(图8) Fluor 的物镜的能力。这些物镜有时称为 半复消色差,并且可以或可以不含有萤石的元素,但由于它们的光学特性的,但却指定由不同的制造商,其名称为 FlPlanFlFluorPlan FluorNeofluor,和 Plan Neofluor 。这一类的当前物镜是在许多配置中,包括用于与多个浸没介质的使用模式可用,并且适合于在明场,荧光,相衬,偏光,和微分干涉对比使用,以及一些共聚焦和多光子应用。

物镜分类 复消色差透镜 通常都是那些对色差和球面像差校正的最高水平(见图8)。 这些物镜通常有最高的有效数值孔径,对于一个给定的放大,和色差和球面像差至少三波长校正。 随着畸变几乎完整的校正,复消色差的物镜一般是适用于任何显微镜技术,虽然所有的技术采用特定的性能要求,必须考虑。 在光学矫正所表现出的消色差透镜异常程度的怨恨,因为他们利用反常色散透镜元件(通常包括萤石),他们可能不适合某些偏光显微镜的应用程序或紫外荧光激发的最佳选择。 因为天然萤石晶体,它可以限制偏光性能降低的最大消光系数可以实现的,并且可能包含有机污染物与不良的荧光性质。 除非一个复消色差物镜是专为偏振光,在近紫外光谱区域,克服的局限性,在萤石物镜(半复消色差透镜)可能提供更好的性能,在某些应用。

共聚焦荧光应用受到严重限制如果物镜像差校正不同样的激发和发射波长,更难以满足要求时,使用或多个荧光团的激发和发射波长之间的差异是大的。 为了实现最大的检测到的光子能量,照明光斑和检测区域的成像在针孔之间必须保持齐焦。 许多物镜,即使在复消色差透镜类,不提供紫外激发荧光技术结合适当的校正可见光发射。 附加的光学元件可以采用在紫外激光源补偿的物镜无法容纳在宽波长范围,虽然这增加了费用和大量的运算复杂度的共焦系统。

高性能水浸的物镜已经最近推出的最主要的制造商,和许多这些物镜是专门设计来满足当前快速发展的研究领域提出的要求。 一个主要物镜是在生物标本共聚焦荧光显微镜实现最佳的性能,包括活细胞和组织的生理媒体支持。 这是认识到,无论像差校正纳入一个物镜的设计水平是必要的,额外的像差可以通过违反设计的操作要求引入外部物镜的光路,这会降低性能的最佳成分。

新的水浸的物镜(见图9)避免这一类型中最常见的问题,这是折射率之间的不匹配和试样浸泡媒体。 他们还提供高分辨率和大数值孔径的设计改进的光收集,并有较长的工作距离。 此外,特别注意的是给定的紫外线波长的高传输,并扩大光学校正从紫外到可见光发射区常见的荧光团,以维持激励和信号采集共焦条件。 奥林巴斯,例如,提供一系列的专业 W LSM 浸水高数值孔径复消色差(激光共聚焦显微镜;参见图2),这是一个大的平场校正,和从约340至650纳米的延长复消色差校正。

专为直接浸泡或水浸的物镜,具有专业的陶瓷或聚合物nosecones,可用于活细胞和生理的研究(图2)。 这些研究往往需要测量或其他操作的标本,不能做有一个玻璃盖。 一般水浸的物镜是在萤石的范畴,在紫外线和红外光谱区具有较高的传输,并设计了长工作距离的规格和插入窄的轮廓(浸渍)在物镜的鼻子部分。 小角鼻上的物镜是为了让附件微电极最大访问标本或执行其他操作期间观察。 长工作距离,这可能与这种风格的一些物镜几毫米,也提供更大的访问的标本。 许多浸物镜浸泡部分是由陶瓷或其它惰性绝缘材料的电气隔离和耐化学性。 他们的特征的组合使得水浸物镜适合活标本共聚焦,多光子电离,和许多其他的成像方法。

除放大,数值孔径,和程度的光学校正的,物镜的 工作距离 在用于获取三维标本信息共聚焦显微镜和其他数字显微镜技术的特殊意义。 工作距离,物镜要求的玻璃罩,被定义为玻璃盖和前透镜元件的顶面之间的距离在盖玻璃接触试样面关注的焦点(图10(b))。 这个距离是重要的时候,共焦成像是在不同深度的标本,因为它决定了最大侵彻深度,是可以实现的重点在物镜接触玻璃盖的顶部。 工作距离,因此,限制的范围内沿 Z 轴从样本数据可以收集。

作为一个例子,与0.20-mm物镜(200微米)的工作距离可以被聚焦到一个200微米以下的玻璃盖的最大深度在物镜上的盖玻璃表面接触。 在一定范围内,工作距离可由光学设计不同,虽然它通常降低放大,数值孔径的增加,和光学校正。 保持大数值孔径和高度的长工作距离的像差校正是通过简单的几何约束条件,通过镜头的元素和在一个高度校正的物镜所需要的数量施加限制的形状。 许多现有的物镜规格代表成绩显著的性能改进的光学眼镜,镜片涂层的有效实现,和计算机设计的能力。

事实上,信号强度是放大的平方成反比,在共聚焦显微镜在优化物镜选择的影响,在某些情况下,改变各种性能因素的相对重要性。 一些研究人员认为,厚的组织切片成像的亚细胞成分,它通常是有利的选择温和放大的高数值孔径的物镜以浸泡半复消色差物镜类别获得最大的光收集。 当利用共聚焦扫描系统与电子变焦功能,它采用100倍光学放大很少是必要的,和高度校正(和高数值孔径)40x和60x物镜可能受益于额外的光收集技术更适合。

许多流行的技术,如荧光成像,从根本上受到这样的低光水平,该光学系统的传输特性是至关重要的。 只有少数的光子可用于微小细节的标本检测,并因此在荧光激发和发射波长的传输率的一个相对较小的差异可以在确定一个标记的特征可探测的关键。 在某些情况下,物镜的传输性能可能比其他规格如野平坦度和像差校正的意义更大,这需要额外的镜头和涂料,可以增加一个关键的波长频带的光损耗。 复消色差校正可能危及其他物镜的要求,正如前面所讨论的关于偏振光的性能,并降低光传输中的紫外或近紫外范围一直被一个全像差校正的成本。

在较宽的波长范围内提高传输性能物镜的同时还实现了高水平的像差校正已在共聚焦荧光应用尤为重要,许多最近的高性能物镜,包括水浸泡,已在紫外高传输优化。 它是在技术使用波长考虑物镜的传输性能的重要,这样的数据通常可从物镜的制造商。 特定的光谱传输特性的光学玻璃组成的确定,采用的水泥复合透镜元件之间,和涂层的透镜表面。 作为透镜设计的复杂性增加,涂层的透镜的重要性减少内部反射已变得越来越重要。 早期简单的单层涂层大大提高了整体的传输,并不断细化的专有材料的多层涂层进一步使透镜设计师拓展所需波段物镜传输,即使镜片数量和物镜的整体的复杂性显着增加。

专业的技术被应用于细胞和分子生物学的问题迅速发展的领域,以及在其他领域,导致了在要求对光学成像系统的变化,特别是考虑到显微镜物镜。 生物标本的三维调查在共焦扫描技术利用的急剧增加是影响产品的商业开发的一个主要因素,虽然方法如激光捕获,多光子激发荧光共振能量转移 FRET ),荧光 原位 杂交FISH ),和红外微分干涉对比也提出了新的要求。 一些专门的技术参数表明了某些传统的物镜的绩效标准可以是至少部分地牺牲为了提高其他更重要的规格。 在计算机辅助透镜设计和光学玻璃配方的巨大进步,除了那些在抗反射涂层技术,使得能够满足许多新的要求,改进的光学导论,很少或没有权衡在传统的宽视场显微镜。 这些具有更高的数值孔径高性能水浸泡的物镜,增加工作距离,球面像差校正衣领,和增强的紫外线和红外线传输物镜。

许多现代的物镜是适合使用在激光共聚焦显微镜时,利用其设计规范的一致性。 对于许多应用程序,以小于全复消色差校正的物镜,如萤石类半复消色差透镜,是作为一个通用的物镜,可以在多聚焦技术的一个理想的妥协。 高分辨率的检测及与激光扫描共聚焦显微镜厚水标本的精确三维成像是特别的要求和需要满足以下所有标准的物镜:高效荧光收集高数值孔径,长工作距离允许的最大穿透深度,精确的三维重建的平场,低轴向色差的多个荧光团的齐焦,和较低的横向色差,使多个荧光图像的精确配准,除了高传输在激发和发射波长。