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奥林巴斯显微镜全内反射的基本结构

2014-09-26  发布者:admin 

光学结构的宽光谱划归审议过程中仪器开发的全内反射荧光显微镜检查(TIRFM)的早期阶段。从这一努力出现一个数字,满足在不同折射率的两种材料之间的接合处产生的薄渐逝场的要求设计的。

在倒置显微镜下为这些设计的大部分,主要是由于添加TIRFM光学上的方便,而不是下面,笨重的显微镜台。 立式显微镜的结构也可以利用,尤其是当这是唯一可行的选择,实验条件或调查员的预算。 与生长的细胞在单层培养在塑料培养皿底细胞基质接触的观察是一种直立显微镜很好的候选人,尤其是当与浸渍的锥体采用水浸的物镜。 倒置显微镜更有效时,检查细胞或膜组件连接到一个密封的标本室上部或当物镜是用来照亮和检索从试样的二次荧光发射。

无论基本的显微镜的设计,大多数目前使用的TIRFM结构依赖增加棱镜激光直接光照往何处发生全内反射界面,这是样品中的共聚焦平面的显微镜。 也可以用显微镜物镜的同时直接照射到接口和实现第二荧光发射的激发荧光基团产生。 本文讨论了许多的TIRFM基本的显微镜的结构,并假定例标本是在组织培养中的一个或多个荧光染料标记,在单层附着在玻璃盖玻片在全内反射界面生长的细胞。

图1中给出的是一个典型的TIRFM仪器结构涉及一个倒置的组织培养显微镜,梯形棱镜块,外加激光照明,和一个光电倍增管/ CCD探测器系统的组合。 发出的激光经过先扩束后成一个分束器将显微镜入口端口和梁主任镜之间的淡蓝色的光。 在导演的镜面反射,光的一部分被聚焦透镜到梯形棱镜放置在显微镜载物台上方的标本室和物镜集中。 棱镜把光照在一个角度,略大于内部全反射的临界角的TIRF接口,创建一个渐逝场激发荧光的样品。 光的分束器通过另一部分进入显微镜的港口,在那里它可以被引导通过光培养宽视场落射荧光激发试样。 二次荧光的样品发射的物镜是收集并传递到目镜的CCD摄像系统,光电倍增管(PMT),或。 由于梯形棱镜的顶是平的,从钨卤素光源照明可以用来观察样品在透射模式使用一系列的对比增强技术,包括微分干涉相衬,相对比,暗视野,和霍夫曼调制对比度。

当设计TIRFM实验,在构型的主题考虑的最重要的因素是照明的临界角。 普通的玻璃盖玻片上,在组织培养细胞通常生长,有约1.52的折射率的介质时,周围的细胞和细胞内成分的折射率的范围从1.33到1.38。 因此,在细胞膜和盖玻片之间的接口获得全内反射( N(2)/n(1) =1.52/1.38),入射角必须大于65度的临界角。 如果细胞是不完整的和已透,溶血,超声处理,或固定,然后低折射率的水性缓冲液( N(1) = 1.33)而不是细胞质,和临界入射角度减少到61度。

奥林巴斯显微镜在原则上,可以采用传统的卤钨或汞/氙弧灯进行技术试验,但大多数的文献报道的调查是在激光照射下进行。 激光器是如此广泛的首选的最主要的原因是,激光是相干光,偏振,和准直,这样就可以很容易地引导到物镜或棱镜扩束镜,使用标准,和聚焦透镜。 当激光源是正确对齐,全内反射界面被定义的几何形状,可以很容易地调整,以适应变化的区域试验。 高强度的激光源,也为实验要求的照明相当重要,如荧光漂白后恢复(FRAP)的调查和荧光比率测定。

为tirmf实验最流行的激光源是1至3瓦的空气和水冷却的连续波氩离子系统,在488和514纳米,具有很强的发射线,提供广泛的普通荧光激发的能力。 在较长的波长具有线激光器,如氦、氖、氪离子气体激光器,可用于激发荧光团的吸收在540纳米和较高的地区。 然而,几乎所有的激光在0.5瓦的总可见输出或更大的范围应该足够了。 激光源是一般可取为TIRFM弧灯,因为在强度严重降低电弧灯发出的光准直的结果。 然而,激光照射有不可避免的干扰边缘上的试样,可以通过精心清洗光学表面有所降低。 临界实验,研究者应该探索快速抖动的激光束,或至少计算一个正常的使用由一个均匀的荧光团的浓度控制的数字图像样本的数字图像。

倒置显微镜的结构

为了实现在倒置显微镜下培养室全内反射的激光直接照射在玻璃立方体放置在腔室顶部的最简单的方法,如图2所示。 在一般情况下,一个固定的显微镜(物镜转盘/物镜组合是翻译在聚焦)比移动台显微镜更方便。 这种结构使试件将聚焦的过程中保持静止,只需要对激光束的初始对准。 然而,移动台显微镜是更常见的,两种类型可用于这些实验。

在倒置显微镜的结构被认为是在这里,缓冲区填充的样品室由一个较低的赤裸的盖玻片,60微米厚的聚四氟乙烯垫片环,和细胞粘附盖玻片倒使细胞的脸朝向物镜。 这种设计的优点是细胞没有绑定到基板,松散的细胞碎片,和污染蛋白倾向于沉积物作为一个集合到室底无遮蔽或添加外源荧光全内反射界面。

单层细胞的盖玻片组合的上表面被放置在与玻璃块光接触(或棱镜)由一层薄薄的浸油或甘油的方法。 玻璃块的侧面应固定,但样品必须能够接受的翻译在x和y方向的同时仍然保持光学接触。 下盖可以过大和聚四氟乙烯垫片通常是有差距,缓冲溶液浸泡的细胞可通过毛细管作用具有入口和出口端口(图2和图3)。 一些制造商提供的组织培养室是专为这个物镜。

如图2所示,激光光束首先进入一个聚焦透镜倾斜放置在显微镜载物台。 镜头的物镜是将激光照射在几乎相同的方式,作为一个物镜在EPI照明,但镜头也更容易对准的窄波束宽度。 透镜的焦距是不重要的,50和100毫米之间的范围,但应允许研究者很容易改变照明面积的大小在一个狭窄的范围内。 在照明系统其他组件,聚焦透镜应安装在一个轴与入射激光束方向对准X-Y-Z翻译。 译者可以安装在实验室的工作台上或显微镜的阶段,但会更容易使当它被安装在舞台上。

三个主要的光学元件和直接控制激光束的大小和途径进入聚焦透镜之前(见图1)。 这些包括扩束器拓宽激光光束在退出腔,一个分束器(可选)或反射镜,和一个光束导演将光束聚焦到聚焦透镜。

激光光束扩展器的广泛可用一些经销商,并用于在聚焦透镜的光束宽度控制。 作为一个结果,然后通过聚焦透镜确定收敛到样品与焦斑宽度角。 激光光折射在一系列的光束角遇到的立方体的垂直面时。 由此产生的几何畸变的界面处产生一个椭圆的照射区域,这是拉长时相比,一个高斯分布的平行光束的预期模式。 梁是更大的当他们进入聚焦透镜产生具有较薄的尺寸反射点。 在最佳条件下,梁的半宽度接近下限可以达到2.5μm。

分束器是一面镜子,把水平激光束在垂直方向(90度角)来提升它的过去的高度的显微镜载物台和玻璃棱镜或块。 一个可调节的光学安装应该用来房子分束器可移除以允许激光直接进入一个快速和可逆转换为辅助外延照明显微镜端口。 利用部分镀银镜或甚至一个普通的载玻片作为分束器,两个落射照明和全内反射可以同时查看。

梁主任镜采用角的激光束从垂直方向斜向聚焦透镜(见图1)。 镜子高度在全内反射面确定入射角。 除了线性调节高度,导演镜子应该装在一个双轴旋转安装允许的未聚焦的激光束方向进入棱镜。 如果镜像安装连接到移动台显微镜阶段(而不是实验室),的反射区的位置可以被聚焦时,试样的变化不敏感。

正确对齐时,准直和聚焦的激光束进入玻璃立方体,而导演折射罢工的全内反射界面(在立方体的下表面)与入射角超过临界最小。 无论是规模还是的立方体形状是至关重要的,和棱镜或长方形的玻璃块可以很容易地取代。 等边45-45-90-degree棱镜是标准的商业项目,可以从各种来源购买。 一个平顶棱镜(图2和图4),如立方体上面或截断的三角形,使卤钨灯和聚光系统在棱镜安置。 在这种结构中,传统照明技术如明场,暗场,相衬,和微分干涉对比可以耦合TIRFM调查协助确定的荧光源于界面的空间位置。

安装的棱镜或玻璃块,将一滴纯甘油或浸油的文化室的上表面和棱镜慢慢降低到油面,从而传播的液滴成薄薄的一层。 接触媒体(甘油或油)有两个物镜:保证棱镜和样品室之间的光学接触,和机械润滑区的两个玻璃表面之间。 随着标本室侧翻译在扫描过程中,棱镜或玻璃块是固定的。 入射的激光束传播通过棱镜的斜下方,然后通过甘油或油层,最后通过试样,完全反映在基板的底面直接在显微镜的光轴。 基板的厚度是不重要的,除了厚的基板(那些接近一个毫米甚至更多)可能会限制激光束从会议的底面直接在显微镜的光学轴。

浸泡接触的介质(油或甘油)应谨慎使用,因为任何多余的可能积聚在棱镜的下边缘和干扰入射激光照明时,首先进入玻璃。 棱镜的大小并不重要,但是大棱镜可以抑制试样的横向运动,虽然会增加浸泡介质珠和入射光束之间的间隙。 一般来说,一个棱镜或玻璃块与约一平方厘米面积是理想的。

棱镜采用几个令人兴奋的激光系统不需要在折射率精确匹配的幻灯片或盖玻片中发生全内反射。 他们可能与甘油,环己醇的光耦合,或显微镜浸油,其他光不同的液体。 浸没油具有较高的折射率,这有助于避免在棱镜/耦合在低入射角的媒体接口可能全内反射。 然而,许多品牌的浸油表明自体荧光显着量。 另外重要的一点是,截断棱镜表面不需要特殊的抛光处理,但与一个标准的商业显微镜载玻片平滑充分履行。

几个样品室的设计,利用由玻璃和/或盖玻片窗口如图3所示。 左侧(图3(a))是一个 塔姆 室内设计提供一种薄的轮廓,使组织培养的细胞是通过一层薄的缓冲溶液中观察到的,它允许高数值孔径的物镜有很短的焦距的使用。 一个单层的细胞上生长,盖玻片(或显微镜),是从一个具有厚度小于100微米的薄垫片下盖玻片分离。 接入孔,使细胞与各种各样的溶液进行滴定灌流,平衡结合实验,或在细胞表面相互作用的动力学分析。 一个类似的装置,该 德沃夏克史托勒 控制的环境中培养室,是说明了在图4(b)。 该室还利用盖玻片两个顶部和底部的窗口,但不能访问孔或任何机制来允许添加化学品或缓冲溶液的变化。

如图3所示,标本室包含必要的维持培养细胞的水性缓冲液。 这个解决方案是夹在衬底表面和盖玻片之间,相隔一氯丁橡胶或聚四氟乙烯垫片。 聚四氟乙烯环是市售的,具有的厚度范围从50微米以上。 缓冲溶液的深度必须相当薄,如果高放大倍率的物镜具有大的数值孔径和短的工作距离是被雇用。 在许多情况下,该玻璃棱镜在基板上的向下的压力可能是适当的密封样品室无附加卡,但许多室内设计(图3)包括安全机制的基板和玻璃盖玻片。

在情况下,一个棱镜法(而不是一块玻璃)实现全内反射(见图4(a)),最大入射角是通过引入激光束从水平方向上得到的。 标准玻璃(有1.52个折射率),最大入射角为73度的直角棱镜和79度的等边棱镜。 由于三角棱镜上表面不平坦的相位对比度和其他的透射光技术不采用这种结构兼容。 然而,自定义截断和棱镜的顶抛光(显示如图4一个选项(A))产生的表面,可以很容易地通过入射的光从上面通过倒置显微镜聚光系统。

安装在显微镜聚光镜单元时,一个60度的梯形棱镜(图4(b))是最方便和可重复配置开发的TIRFM以上倒仪器阶段。 入射的激光束是垂直的,所以全内反射面积变化的横向一个很小的程度时,棱镜提高和relowered在试样的变化。 此外,传统的透射光技术(相对比,明暗,等)与本实验设计兼容。 由于入射角固定为60度(1.52,普通光学玻璃的折射率)是不能够支持全内反射,并具有高折射率棱镜是必需的。 用燧石玻璃制成的棱镜(折射率为1.64)将符合这些要求,与市售。 光束将折射远离正常的从通过棱镜到盖玻片的69度的角度,从而超过临界角在盖玻片/缓冲或盖玻片/细胞界面。 与墙为45和60度之间的梯形是理想的,但这些单位是不容易的,必须生产出定制规格。 不幸的是,45或60度的梯形也没有市售,但他们可以通过截断和抛光的市售的三角棱镜的顶点的廉价生产。

图5给出了四分之一的结构利用一个抛物面反射镜和半球形棱镜进行倒置显微镜实验。 在本设计中,反射镜和棱镜的位置使激光束穿过一个半径的棱镜对全内反射靶区在凹面镜的焦点。 因为光线进入棱镜几乎正常在所有的入射角在脸上,光束轮廓的像差相比,与一个立方体或矩形棱柱块所观察到的减少。 在垂直入射激光束的横向偏移能总是把焦点放在同一个地方,使大量的、方便的改变光线入射角。 此外,在渐逝场的干涉条纹,可以通过将输入光束分成两个组件创建的,每个反射在抛物线一个单独的方位角位置,但重组在抛物面焦点。 条纹间距可以通过调整两个入射光束的相对方位角位置的变化,和非常高的空间频率可以达到。 干涉条纹,可以作为一种辅助聚焦的接口上创建一个平行线的干涉条纹图案。 这一模式可以在细胞/衬底接触的区域观察到的,这证实了激励源的倏逝场(而不是通过细胞场随机散射光)。 干扰模式也是有用的在表面的扩散速率的研究来衡量的接触区域的膜元件的横向流动。 尽管这个设计的通用性(图5),定位是非常困难的,该系统是更敏感的振动。

倒置显微镜结构审查这里都有一些优点和缺点。 主要的优点是能够利用而廉价的光学显微镜工作台上有足够的空间位置的试样和玻璃块/棱镜和支撑光学元件。 此外,棱镜可以安装在聚光镜支架(安置在现代倒置显微镜阶段)在升降自如,并与传统的光学技术辅助观察。 最后,这些光学安排享受简单设计和最容易对准的全内反射系统。

倒置显微镜的结构主要缺点之一是事实,标本不易从上面和常规照明由棱镜先端阻碍访问。 同时,最短的工作距离的物镜不可能达到聚焦在缓冲层,并具有高数值孔径的物镜图像质量的降低由于球面像差时,观察样品在较厚的缓冲层。

棱镜或玻璃块对齐的倒置显微镜光学系统涉及到对全内反射区直接在物镜而试样在焦点。 第一步是将样品室和棱镜组合,然后将试件在使用明场照明的重点(甚至在棱镜的顶点是存在的)。 接下来,用激光聚焦透镜的光束直接删除,以便它经过的物镜前透镜中心的全内反射。 这可以通过直接观察(不通过显微镜目镜)用于散射入射光在棱镜,浸层,和基板。 重新插入聚焦透镜后聚焦的激光束,使进入棱镜侧面大约一毫米的底部边缘以上调整其位置。 直接观看梁应在棱镜底部显示的散射光三共线性点:两个在外面,光束通过浸渍层,和一个中央地方的光束经过在试样内部全反射。 聚焦透镜应调整中间点是可见的细长圆柱面。 和全内反射区域大小的位置可以用聚焦透镜的翻译和移动透镜的纵向优化照明区域的尺寸调整。

的全内反射区的形状依赖的棱镜或玻璃块侧表面的取向,在激光束进入。 如果一边是垂直的(如在一块或矩形),该地区将长到一定程度,是一个电子束会聚功能。 正如前面所讨论的,延伸率是由于像差的大折射角度首先介绍了棱镜表面或玻璃块。 另一方面,如果侧面倾斜使准直的激光束进入一个角度接近垂直,然后反射区会像一个小的细长的圆锥形部分,预计从切片的圆柱形束在一个角。

在所有上述的光学结构,照亮的区域将保持平稳的视场中心作为试样在横向尺寸扫描。 然而,当显微镜阶段期间移动焦点,照亮的区域可以横向移动作为样本集中,取决于是否聚焦透镜和光束的导演都安装在实验室的工作台上或显微镜阶段。

全内反射点的重点应不大于视场宽度。 如果现场太大,假散射和离焦荧光从棱镜和盖玻片之间的浸油层会增加其他荧光背景低,可能与全内反射荧光显微镜。 另一个工件时的入射角非常接近临界最小,表现为沿界面的表面细胞明显的阴影。 这可以通过一定的入射角超过临界角数度,避免。

当入射角接近临界值,有时很难确定是否已经实现了全内反射。 在这种情况下,通过显微镜目镜观察荧光强度常可帮助研究者确定仪器的正确结构。 从TIRF界面荧光发射是从由入射光束在亚临界“略读”的角度通过缓冲水传播的激发截然不同。 因为倏逝波(不像光束传播)是远小于的重点物镜深度,荧光似乎来源于由全内反射的激发单平面。 相反,落射照明(从亚临界梁)激发荧光团在标本室和二次荧光大部分是在很宽的范围内的焦平面的观察。

局部定性强度测量在总的内部反射的实验,这可能是可取的限制区,从收集的发射光。 经常被照射区域是不可能很小,但确定的表面积可以通过一个可调光阑放置在发射光通路的图像平面上获得。

另外几个TIRFM结构涉及倒置显微镜已被聘用的人员。 该系统如图6所示提供了另一个系统,固定棱镜相对于试样代替激光束。 雷射光从右边进入通过一个入口的棱镜,并折射到基板上传播朝向显微镜光轴通过多次内部反射。 一路上,多重反射光束遇到标本(组织培养细胞粘附在玻璃盖玻片)说明了发色团在玻璃/缓冲界面区。 通过试件和基板后,反射光束进入射棱镜,它将光从实验。 在这种结构中,光照反射区将试样时,翻译。

一个更有用的结构,是兼容的同时注射或膜片钳实验,如图7所示。 为了提供从上面一个组织文化沐浴在缓冲容易和连续访问,棱镜是部署下阶段接触玻璃基板。 这种结构,不可用于所有倒置显微镜,受到严密的几何因为物镜也居住在邻近地区。 如系统如图6所示,台下的棱镜启动多个总的内部反射在盖玻片,这将激励光波导的远轴的视场的中心。

在最简单的形式中,一个小三角棱镜(商用)放置,通过浸泡油或甘油,与含有细胞和缓冲液盖底光接触。 样品可以翻译而棱镜保持横向固定,虽然涂抹油可以在盖玻片可以摧毁第一反射下侧左(实验)。 一个可行的方法是使用一个额外的干预盖玻片与光学透明胶固定到棱镜。 滑动运动发生的干预和细胞的盖玻片盖玻片之间,这是光学接触,由一层薄薄的润滑油或甘油浸泡。 这种结构的一个主要缺点是,油或甘油浸渍物镜无法使用,因为浸泡介质可能会破坏内部反射照明斑的形成之前。 然而,空气(干)或水浸的物镜很好地工作在这种情况下。

直立显微镜结构

梯形棱镜,类似于图4所示(B),可以安装在聚光镜支架在直立显微镜在位于阶段标本全内反射界面观察现象(图8)。 扩展的激光束被引入到显微镜基地使用用于发射光源相同的端口(这应该被删除)。 一个长的焦距(约250毫米)会聚透镜放在门口附近的港口和安装在X-Y翻译用于聚焦入射激光束和允许的横向位置微调。 激光准直照明可以利用显微镜内置的光学列车直梁通过底座和垂直向上进入棱镜。 一个额外的镜头位置略高于显微镜基础往往是翻译和焦点的全内反射点有用的。 这种结构不调整入射角提供了很大的灵活性,但有限的范围内的值可以通过使用具有不同的角的几何形状和折射率达到几个梯形。 图像是通过冷却科学CCD数码相机在图5所示的收集,但一个光电倍增管或雪崩光电二极管可以很容易地取代。

棱镜玻璃折射率的选择是有限的要求,用火石玻璃(折射率为1.62)是优选的配方。 一个60度的入射角,棱镜的折射率必须至少1.53为全内反射发生在玻璃/水界面(无论基板材料)。 这就是为什么火石玻璃,而不是普通的光(皇冠)玻璃或石英,是这些实验的理想的棱镜材料。

照明光被反射到棱镜的显微镜镜下,并透过玻璃折射棱镜的角边。 因为梯形棱镜将自定义尺寸没有市售,菱形截面是由截断和抛光触手可及的等边三角形的棱镜上制作。 聚焦透镜后的激光轨迹定位,这是调整的倾斜侧和朝向的上表面在60度的入射角进入棱镜中心在全内反射的底部。 当聚焦透镜插入光路,光束遵循相同的过程,但更薄、更强烈的。

标本室,这可能是一个塑料培养皿或培养皿,置于显微镜下观察期。 一小滴浸介质(甘油或油)放置在棱镜上,并由聚光器齿条机构提高带来的文化室的下表面的光学接触。 然后是激光束的聚焦透镜位置译者调整内部全反射在燃烧室的上表面(或基片)和遵循一个对称的过程返回在棱镜对面镜座。 此设置适用于许多类型的基板,但特别适合观察细胞在塑料培养皿底部生长。 然后,细胞可以被视为在该室最初被播种后没有重新安装步骤。 在一个直立显微镜观察试样使研究者同时探测细胞微量移液器,片夹,和注射器,提供物镜有足够的工作距离。

二次荧光发射可以通过干燥,收油,或水浸物镜(调迁后的大部分缓冲)通过盖玻片,悬浮的细胞单层表面上方间隔。 另外,一个倾斜的锥水浸物镜可以直接放置到缓冲溶液浸泡的细胞。 直立显微镜结构是非常方便的,因为样品可以互换,因为他们很容易与标准照明系统。 的TIRF照明区域的位置也通过固定和不受影响的,即使在移动台显微镜,占绝大多数的现代正立显微镜设计。 主要的缺点是没有切换到另一个棱镜具有不同的倾斜角度的入射光角度不可调。

一个直立的系统提供了高质量的图像水浸时的物镜是潜到直接通过发现培养皿或培养室的缓冲溶液中图像的细胞,但结构是否存在几个缺点。 许多用于培养容器结构的聚合物制剂有一定程度的荧光,这可能会降低弱荧光样品的对比。 这种效应可以复合如果浸耦合介质不慎重选择。 浸泡油的几个商业品牌也显示荧光在不同层次,调查员警告检查浸入油和塑料培养器皿潜在的荧光效应在使用它们之前的TIRFM实验。 不同品牌的组织培养塑料在显示在激发自体荧光的量有显着的变化。

棱镜,滑动窗口和盖玻片,室,可以在大多数应用普通火石光学玻璃制成的,除非短穿透深度从高折射率产生所需的。 光学玻璃不透光的低于约310纳米,也有一个较长的衰减时间,昏暗的光反射,可以在一些漂白实验问题。 高质量的自发光的熔融二氧化硅(石英)要低得多。 更奇特的高折射率的材料,如蓝宝石,二氧化钛,钛酸锶,不会受到高水平的荧光产量渐逝场的穿透深度超过比光波长低一个数量级。

荧光检测

不同的共聚焦和多光子显微镜,许多TIRFM图像可以被记录在电影中的方式类似的显微镜,在很大程度上依赖摄影经典形式(明场,暗场,微分干涉相衬,,等)。 在某些情况下,尤其是当只有几个荧光标本中存在的,最好是使用更敏感的成像设备,如强度增强的冷却CCD摄像机,科学,雪崩光电二极管,或光电倍增管。 时间推移cinemicrography也有可能在TIRFM实验,和图像帧序列可以与任何上述设备拍摄,其中选择将取决于二次荧光强度和暴露时间获取图像。 丰富的荧光样品可以记录在胶片上(或单独一帧序列),但图像采集与视频或CCD摄像机是目前硬件现成的调查人员更方便。

通用性大量时提供的图像获取与光电倍增管或雪崩光电二极管。 光电倍增管通常采用空间悬而未决但快速检测和荧光强度的定量分析。 可变孔和/或图像平面膜片(以上)使研究者可以选择性地捕获的完全可用字段的部分。 这是有用的当长的采样间隔在低光照水平是必要的,或只有部分的视场的兴趣。 光电倍增管的光谱特性,应当选择一个图像采集装置的考虑,这些应该被检查的荧光团的发射特性一致。

结论

在一般情况下,全内反射更难在显微镜由于激光束的焦点调整需要调整到显微镜的焦平面与光轴移动阶段已经实现。 当选择一个显微镜技术研究,注重机械稳定性和乐器的结构基序。 倒置或直立显微镜在隔离表一个沉重的框架将使研究者建立脆弱的渐逝场的相对振动自由的环境。 聚焦激光照射源保持在几微米的范围内长时间是困难的(最好的),但可以通过当显微镜,激光光源,并支持光学元件固定在适当的安装和牢固地固定在工作台或显微镜阶段。

广泛的显微镜物镜的设计与实验兼容技术。 唯一的绝对的要求是,物镜有足够长的工作距离观察接口在缓冲溶液的垫片厚度薄差距的定义。 聚四氟乙烯和氯丁橡胶垫片可以比任何标准的物镜工作距离较薄,同时仍然比渐逝场的穿透深度大得多。 这减少了无法专注于接口的可能性,但并不能弥补潜在的畸变,在样品/缓冲区的折射率变化引起的。 在大多数高放大倍率的物镜的球面像差校正的关键取决于试样被立即在盖玻片的远侧,而不是在一个额外的薄水层。 结果可以是一个图像对比度不足,产生朦胧的形象甚至当锐聚焦。物镜 规范没有一般的规则可以提供,但水浸的物镜(或浸渍或那些需要盖玻片)可能是最好的(也是最贵)的选择。 另一方面,TIRFM实验已经成功地进行了与几乎所有市售的数值孔径和放大的物镜。

在许多研究,它是理想的快速开关的照明之间的界面的全内反射和更深入地渗透到试样的体积由经典的落射荧光照明。 作为一个例子,一个短暂的过程中可能涉及的同时,但有些不同,在膜和细胞质的变化,两者都必须被记录。 专门设计的光电系统,利用声光调制器由若干研究已经描述了。 这些结构是由电脑控制的,通常包含多个调制器的行为同步振荡TIRF和落射荧光宽视野之间的亮度,同时采集数据与光电倍增管和快速响应的光电二极管装置。

玻璃表面支持细胞的粘附性往往是涂有特定的基板技术研究。 的二氧化硅的表面化学衍生物可以产生独特的物理和化学吸收特性,在调节模型膜和类似结构的形成是有用的。 此外,某些特定的化学共价结合在细胞生物学和生物物理学是特别有用的。 细胞粘附可通过附件的多聚赖氨酸对玻璃表面增强,和疏水性的表面可以长链碳氢化合物的脂质单层吸收了。 其他有用的分子,可用于治疗表面选择性特异性包括抗体,抗原,平面的磷脂,和外源凝集素。

层铝薄(20纳米的区域),它可以淬灭荧光,也可以应用于标准的真空蒸发玻璃表面。 沉积厚度可以通过完全蒸发前测铝量的精确控制。 沉积后,铝膜的上表面自然氧化物在大气中产生一层薄薄的铝氧化物。 氧化物涂层膜具有相似的二氧化硅的化学性质,可以衍生的在一个类似于玻璃的方法。 一种金属膜几乎完全淬火的荧光团的荧光在约10纳米的能力允许从标记的蛋白质的非特异性吸附到衬底的信号抑制。 这发生在允许从更遥远的标记的蛋白质吸附到附着膜荧光。

不同的共聚焦显微镜的光学部分,产生排斥的焦点发出的光与一组的图像平面针孔光阑,TIRFM是有限的地区在几百纳米的玻璃/缓冲界面的全内反射的发生。 激光共聚焦显微镜具有通用性明显的优势,因为光学切片的作品在任何平面的试样并不仅限于不同的折射率之间的接口。 然而,TIRFM确实有几个优点包括一个非常薄的光学部分(约100纳米和600纳米的共焦),相邻的界面附近区域选择性的照明,并有能力(相对便宜的)适应现有的显微镜利用技术。