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尼康显微镜减少光晕与变迹相衬

2014-09-26  发布者:admin 

  光的吸收差异往往是在活细胞内的各种细胞内的成分和质膜之间可以忽略不计,使他们几乎不可见的观察时,利用明场照明的经典技术的显微镜。 相差显微镜利用微小的折射率的差异在细胞成分和未染色的细胞和其周围的水溶液中,在这些和类似的透明标本产生的对比。

光通过 环孔 ,安装在聚光器焦平面,用以照亮在常规相衬显微镜标本(图1)。 为空心圆锥体发出的光相环遭遇透明标本,它是经亚细胞成分和膜或通过非偏移。 光穿过标本非偏移到戒指形状的物镜的后焦平面,而微弱光标本衍射分布在焦平面上的整个表面。 一个小的相移约四分之一波长相对于光直接测量在光诱导的试样衍射。

相位差的光直接从背景和衍射光从样品使两束光互相干涉在中间图像平面。 这是通过添加或减去一个四分之一波长转移到直接的光的半透明的相位板放置在一个平面,共轭手段达到(物镜后焦平面)的环在聚光镜(聚光镜前焦平面)。 直接的背景光是由一个中性密度薄膜的物镜相环采用衰减。 在中间图像平面,一个干涉图案的结果,产生强度由样品引起的相位偏移的比例。

 

在相差显微镜一个不幸的工件是 光环效应 其结果,在虚假的亮区周围的物体或反相位图像中的对比度。 这种效果是特别普遍的标本,产生大的相移。 晕工件减少曾经被认为是一个理论难题,但物镜相环结构的最新进展已经导致了一种新的技术称为 变迹相对比 (图2),它允许有大的相位差来查看和拍摄的高清晰度和细节的定义相对象结构。

图2给出了一个传统的(或经典)和变迹相板定位在一个角度观察切片通过为了便于说明中心。 左边的经典相位板,位于物镜后焦面,有一个薄环的中性密度材料(称为相位膜)应用于表面(图1也说明)。 这部电影的物镜是延缓直接光线透过标本由四分之一波长允许建设与衍射光在中间图像平面的干扰和破坏阶段。 图2右边的是一个变迹相板图。 在这个板块的周边相膜是半透明的中性密度材料的两个同心区域,减少从样品在小角度衍射光的强度。 变迹相差显微镜,这相位板取代了板在物镜后孔左。

变迹相板在显微镜下看到的图像效果如图3所示为两个标本。 图3(a)是一个照片的海星胚胎与尼康 显微镜 Eclipse E600相衬模式操作标准。 其物镜是使用长工作距离( 随钻测井 PH1 DL (明暗)设计生产上的浅灰色背景暗图像的轮廓。 这种类型的物镜是用于细胞和其他生物材料的常规相对比检查最流行的类型,因为它具有折射率的差异主要对象产生了强烈的明暗对比。 注意周围的胚胎的外周和对比度和图像细节的细胞团中央部分缺失的光环。 一个显着的改善对比度是一个具有切趾相位板相应的物镜观察使用,如图3所示(B)。 在这张图中,海星胚胎有显着减少晕周围和具有锋利的边缘增强的内部样本的细节和明显的景深。

一双类似的照片是在图3所示(C)和3(D),用活眼虫标本。 眼虫属的原生动物顺序Euglenida成员,单细胞生物的一个显着的组,其中许多展品的植物和动物的特征。 图3(c)提出了一个经典的相位对比图像的眼虫标本采用DL阶段物镜。 内部样本的细节有一个模糊的对比度和外细胞膜包围的巨大光环。 当同一标本采用变迹相光学(图3(d)),减少晕的大小和内部样本特征更高分辨。

变迹相对比理论

折射率( N )大多数位相物体,尤其是活细胞,范围1.36和1.37之间的照射时,具有平均波长的光集中在可见光谱区(550纳米)。 有一个球形的几何形状的试样,试样和周围介质随试样厚度的增加之间的相位差,导致偏离的标本的光一个较小的衍射角。 假设一个球形试样,最大相位差(δ)和直径( D )由以下方程

(1)
δ = (2Π/λ)(n' - n)d

在λ是光在真空中的波长(或空气), N’ 是样品的折射率,和 N 是周围介质的折射率(通常是一个缓冲水溶液)。 这是明显的从方程,增加试样的直径( D )将非法相应较大的相位差(δ)在照明的波前,提供的样品和媒体的折射率保持不变。

现在,我们将考虑的圆孔直径产生的衍射图案 D 在理想的情况下,当物镜是无像差和提供了一个统一的圆孔,相邻的两个点是解决当他们通风盘中心的距离 R ,中央艾里斑半径。 数量 R 由方程确定

(2)
r = 0.61λ/n(sin(Θ))

在λ是光与空气的波长作为浸介质和θ是衍射角(角度)。 在这个讨论中,我们假设孔径 D 等于分辨率的距离 R ,然后能状态

(3)
r = d = 0.61λ/n(sin(θ))

该重排

(4)
sin(θ) = 0.61λ/nd

代入方程(1)为方程(4)的收益率

(5)
sin(θ) = (2π/λ)(n' - n)0.61λ/nδ

 

(6)
sin(θ) = 2π(n' - n)0.61/nδ

如果衍射角(θ)是小的,然后是长期之间的反比关系 sin(θ) 和相位差(δ)

(7)
sin(θ) ∝ 1/δ

为了研究衍射和非偏移光强度在中间图像平面上,我们必须首先考虑照明波前的物理方面。 如果照明波前均匀平面波入射波前,然后(φ(0))和波前通过相位物体后(φ试样;(1))可以由以下方程描述

(8)
φ(0) = sin(ωt)

 

(9)
φ(1) = sin(ωt + δ)

在ω为照明波前角频率, T 是时间,和δ通过标本或通过周围介质的波阵面之间的相对相位差。 在大多数情况下,δ小的价值,所以,方程(9)降低

(10)
φ(1) = sin(ωt) + δcos(ωt)

方程中的第一项(10)描述了入射光波(方程(8))和代表衍射或直接光通过和周围的标本,而第二个术语表明笔由标本衍射的光线。 在大多数情况下,衍射光有一个四分之一波长的相位差相对于直接光,和幅度,是由样品引起的相位差成比例的。 考虑到加(或减)的四分之一波长的光的直接部分通过一个适当的分区相位板的使用物镜后焦平面,方程(10)降低

(11)
φ(1)=(1 +δ)cos(ωT)

到达强度( I )在中间图像平面波,我们可以把方程的平方(11)将删除时间依赖性

(12)
I = (1 + δ)2

图像强度成正比 (1 +δ) 2 因为平方余弦积分常数。 因此,衍射角之间的关系,通过试样的衍射光的振幅和相位的差异,建立了。 从方程(12),这是明显的,在中间图像平面上的光的强度是在直接的振幅总和的比例和衍射光。 应当指出的是,衍射光的强度和位置的变化,而光领域,直接在图像平面均匀。

变迹相板

在实践中,晕还原和试样的对比度的增加,可以通过选择性的幅度利用获得的过滤器位于建成的物镜在后焦平面的相位板相位膜相邻。 这些振幅过滤器包括中性密度滤光片薄膜应用于周围的相片如图2所示的相位板。 的相移圈在经典的相位板的透过率约为百分之25,而相邻的环周围的相移圈在切趾板对有透射率为百分之50的中性密度。 在两个板的相薄膜的宽度是一样的。 这些值的相移薄膜应用于相衬显微镜标准板的透射率值一致。

周围的中性密度薄膜可由衍射角计算出必要的宽度(θ),讨论了方程(2)通过(7)。 这个值是有些标本的依赖,但商业变迹相物镜可以从尼康制作假设一个对象(样本)约10微米的直径,用于组织培养实验生物细胞的典型值。

在图4中给出了变迹相位对比技术的基本原理,说明了小型和大型标本的影响。 之间的关系在不同尺寸的试样的相位差,严重影响变迹相板衰减的影响。 光的衍射的较大的标本慷慨的一部分(大于或等于10微米的直径;图4(a))通过中性密度吸收环和将被衰减,从而降低强度。 另一方面,标本,直径小于10微米,如核仁,细胞膜,细胞质颗粒,衍射光会通过对中性密度过滤器的外周由于大的衍射角。 在这种情况下,衍射光的振幅将不会通过相位板的透明部分的衰减,在高对比度细节渲染标本(但伴有晕)。

切趾技术已与其他的光学配置成功地用于减少在孔直接光强度。 在任何衍射极限的成像系统的点扩散函数,通常有侧裂片或显着的强度侧环。 这些文物可以设计解决弱点光源位于相邻的一个强大的点源系统相当的关注。 术语 切趾 来自希腊词“清除脚”。 在光学方面,“脚”被认为是在一个有限的衍射成像系统的侧裂片或侧环。 类似的技术,在数字成像中常用的术语,是已知的 窗口

一般来说,一个光学系统的变迹要求振幅衰减的介绍(或在某些情况下,增强)光通过出瞳。 的衰减量在瞳孔的中心通常是可以忽略的,但与半径的增加而增加,成为最大的在附近的孔径瞳孔边缘。 换句话说,在孔径图像的边缘可以“软化”的光衰减面膜的介绍。 因为在边缘波起源于边缘突然孔径衍射的结果,软化效应有助于传播的衍射波明显起源地区较广。 这个结果在抑制振铃效应的边缘波。

切趾的经典被用来提供一个逐渐变细的透射率接近光通过为光学系统的出瞳来抑制旁瓣的周围的点扩散函数的边缘强度。 然而近年来,切趾,已经应用到其他系统,用来描述任何引进吸收入瞳,无论旁瓣抑制或杂音。

总之,变迹相对比的结果在显着提高光学图像的利用率,减少了晕和微小的标本细节对比度高。 在大多数情况下,亚细胞的功能(如核仁)可以明确区分为暗对比与已切趾的物镜,但这些特点有明亮的光环或成像为亮点,使用传统的相位对比光学。 与切趾光学,对比是扭转由于衍射光的相对大的振幅,直接光线透过标本。

从相位物体图像的对比度可以通过调整透光率和环形中性密度区围绕中心相薄膜尺寸的改变。 如果这些区域与梯度的透射率产生,然后对象的对比可以为各种不同的试样尺寸更紧密的控制。