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奥林巴斯显微镜的图像亮度

2014-09-25  发布者:admin 

  无论是利用光学显微镜的成像方式,图像的亮度是由物镜的聚光能力,这是一个数值孔径函数。 正如显微镜光源照明亮度的平方器工作的数值孔径的测定,试样的图像亮度的物镜的数值孔径的平方成正比。

不像在显微镜的照明系统,形势然而,物镜放大倍数确定图像的亮度也起着重要的作用。 事实上,该图像的亮度的横向放大率的平方成反比

图像的亮度∝(Na/m) 2

在那 na 是物镜的数值孔径和 M 为放大倍数。 在上面的等式给出比透照表示物镜的聚光能力(注:用Epi照明的情况有所不同,下面讨论)。 对选定的物镜有不同程度的光学校正光功率的例子列于表1。 在一般情况下,具有高数值孔径的物镜也更好的校正像差。 因此,对于相同的放大倍率,高数值孔径物镜收集更多的光线,产生一个明亮的和更好的校正后的图像(见表1),和总体形象是更好的解决。

这是明显的从检查表1中的数据的情况下,一个物镜是用于透照,在一系列具有相同的校正物镜的放大倍数增大图像的亮度迅速下降。 与此相反,的EPI照明物镜的一系列类似的利用产生了越来越明亮的图像的放大倍数增大通过较低的范围(10倍,但往往通过40X)在高放大倍率的降低。 同样明显的是物镜在落射光照产生更明亮的图像的趋势(如反对透照)在高数值孔径值。

条款 F(反式) F(EPI) 这是利用在表1指的是一个物镜的聚光能力,并根据下面的公式计算

F(trans) = 104 • NA2/M2

F(epi) = 104 • (NA2/M)2

在理论上,光照强度取决于聚光镜数值孔径的平方和的光源图像demagnification广场(实际上,视场光阑图像变亮,因为它是小的,根据平方法)。 结果表明,试样的图像亮度的物镜的数值孔径的平方成正比,当它到达目镜(或相机系统),并对物镜放大倍数成反比。 因此,当检查标本在透射光,而不改变电容影响响应和放大的数值孔径变化的图像亮度变化的目的。

选定的物镜光功率
纠正 放大倍数 数值孔径 F(trans) F(epi)
Plan Achromat 10x 0.25 6.25 0.39
Plan Fluorite 10x 0.30 9.00 0.81
Plan Apo 10x 0.45 20.2 4.10
Plan Achromat 20x 0.40 4.00 0.64
Plan Fluorite 20x 0.50 6.25 1.56
Plan Apo 20x 0.75 14.0 7.90
Plan Achromat 40x 0.65 2.64 1.11
Plan Fluorite 40x 0.75 3.52 1.98
Plan Apo 40x (oil) 1.30 11.0 18.0
Plan Fluorite 60x 0.85 2.01 1.45
Plan Apo 60x (oil) 1.40 5.4 10.6
Plan Apo 100x (oil) 1.40 1.96 3.84
Plan Apo 100x (oil) 1.45 2.10 4.42
Plan Apo 100x (oil) 1.65 2.72 7.41
表1

在落射光照的情况下,适用同样的考虑,除了物镜也作为聚光镜,这必须考虑到当考虑到图像的亮度。 作为物镜放大倍数的增加,降低了光源的图像(demagnified)的等效量,导致在一个亮度水平是不物镜的放大和数值孔径越依赖(亮度是由在落射照明数值孔径第四功率)。 在实践中,图像的亮度数字有所不同(见表1)由于物镜后孔径大小的差异。

当光线水平限制,高数值孔径的物镜应采用,但两者的物镜和目镜放大率应保持在所需的分辨率兼容的最低水平。 在许多情况下,制造商现在提供的油浸物镜的数值孔径和相对较高,更高的图像的亮度值,比类似的放大率高的干同行。 例如,复消色差物镜40x的计划表1中已两次计划的消色差透镜40X干物镜数值孔径,并产生四倍的图像亮度在透射光。 这些物镜产量的落射荧光照明下的图像亮度的16倍的差异,与高数值孔径油浸版生产最亮的图像。 图2给出了在光锥尺寸低和高数值孔径的物镜之间的相对差异的比较。 请注意,高数值孔径的物镜有一个更大的光锥,较大的内部透镜元件,并且能够收集更多的光线从样品比物镜具有较低的数值孔径。

通过显微镜的光学元件发出的光的量,作为入射强度的功能,是特别重要的荧光显微镜。 在这种情况下,高分辨率荧光成像需要高倍率最小损失图像的亮度,高数值孔径物镜的光传输最大程度应采用。 正如上面所讨论的,随着放大倍数增大图像的整体亮度迅速下降,所以荧光显微镜的组成应仔细选择最大的光穿过光训练量。

如上所述,荧光显微镜,利用EPI照明配备物镜服务的聚光镜和物镜的双重目的。 光通过激发滤光片,在滤光立方体的双色镜面反射首先通过物镜形成一个倒锥形照明需要激发试样。 二次荧光通过连接到试样的荧光团发射则是由同一物镜系统收集和传递回通过双色镜和屏障过滤之前被投射到目镜或成像系统。 高数值孔径的物镜作为一种聚光镜会增加信号(光)中的方式,是对数值孔径的平方成比例的强度。 由于物镜的聚光能力,也是对数值孔径的平方成正比,图像的亮度会有所不同的物镜的数值孔径第四功率根据方程

图像亮度(荧光)∝钠 4 / M 2

请注意,在荧光显微镜下,亮度也到物镜放大倍数成反比的方。 因此,对于相同的放大率的物镜,两者的光场图像的亮度与物镜的数值孔径的荧光图像的显着增加,这是主要的原因,制造商生产的设计与荧光显微镜高数值孔径的物镜。

采用观察标本进一步放大的衍射限制的图像投射到显微镜的目镜中间图像平面,和也有助于降低整体强度的标本。 事实上,图像的亮度的目镜放大率的平方成反比,要求有最低的放大需要方便地观察标本采用荧光目镜。 因此,可以通过使用可用的最高数值孔径耦合到功率最低的目镜的最大荧光显微镜图像的亮度(虽然10X目镜是最常用的)。 这些评论主要适用于大样本地区有照明均匀度。 在高度集中的光源点的情况下(例如,分钟的荧光微球),粒子图像应有限衍射和尺寸是独立的放大。

提高试样的信号

在荧光显微镜,图像的亮度的光照强度的测定,荧光的量子产率,和显微镜的聚光能力。 更大的光照强度和量子产率较高,更大的荧光信号和明亮的图像变得直到所有的荧光基团的饱和。 同样,在偏振光,图像的亮度是受光照强度与试样折射延迟。 在值到一个四分之一波长较大的延迟的延迟,产生更大的双折射,从而更强的信号。

在这两种情况下,图像的亮度是从样品的信号控制,这是一个产品的光照强度和光的试样引入的变化。 在发光的情况下,在标本本身发出的光亮度,显然是由光的大小,或信号,由样品发射。

这一概念是在图3和图4所示的荧光和偏振光标本,分别。 图3给出了从夹竹桃叶薄片被落射光照条件下的一个立体显微镜配备荧光照射对数字图像。 当薄片与赋予绿色荧光蛋白(GFP)激发具有450和490纳米之间的带通滤波器组的范围内,试样表现出弱的绿色荧光(图3(a)),标本中的某些部分非常明显,但很弱的人。 相反,一个较长的波长的带通滤波器组试样激发(530-560毫微米;图3(b))产生一个明亮的红色荧光具有更强的信号在薄片。

类似的情况与极化矿物薄切片光镜观察,如图4所示。 试样抛光的30微米区段斜长岩,火成岩几乎完全由长石。 当高度取向的双折射薄膜部分设置与光轴垂直于偏振器,光(信号)通过分析仪最小化(图4(a))。 然而,当光轴取向在45度角相对于分析仪和偏振器(图4(b)),光的最大数量被目镜或图像传感器。

在其他模式的显微镜,如相衬,微分干涉对比(DIC),暗场,霍夫曼调制对比度,等,照明和图像对比度的强度可以独立变化。 然而,信号从图像,即图像的亮度,每在一个光学参数变化单元的增量(例如,不同的路径长度),仍然是由光照强度和生产的单位变化的光学参数的对比确定产品。 检测任何光学参数的微小变化,其技术人员应该最大限度地从特定的参数变化所产生的信号。

通过显微镜透射光

对于一个给定的聚光镜和物镜的数值孔径,放大,和照明亮度,图像亮度的显微镜生产仍然可以根据透射光学元件的变化。 光传输取决于几个因素,包括吸收的镜头和水泥,反射损耗的光纤接口,和透射率的灯套,漫射屏,过滤器,偏振器,和其他辅助光学元件。 一组选定的高数值孔径物镜的典型的传输曲线如图1所示。 这些值是更多或更少的从一个特定的制造商的任何类物镜的代表,但即使在这些测量曲线的具体类型,准确传递的值可以变化有所不同,例如,抗反射涂层,用单个透镜玻璃批量。

透光率(强度发射的入射强度的百分比)的一些光学元件可以在可见光范围内的波长依赖性,如图1所示。 同时,在可见光范围内的波长,透镜,棱镜的透射率,幻灯片,和样品的安装介质可以下降明显。 这是由20倍的计划氟物镜传输特性曲线如图1所示的例子,说明在透光率稳步下降,在波长为400和700纳米之间增加。 该系列中的其他物镜没有表现出这样的一个显着的程度的波长依赖性。

200以上的光学玻璃的配方已被开发和可用的光学设计师纳入显微镜透镜,反射镜,过滤器,和分光镜。 这些眼镜的属性,如折射率,色散,传输,污染物,潜在的自体荧光,化学和热电阻,和整体性通常是精心挑选,保证最大的光学性能。 然而,这些因素往往妥协的其他要求,如在近紫外范围或高消光系数高透射偏光显微镜 一些新的材料,如玻璃的方法fluorocrown,天然萤石性能同时避免它的缺点,如有机污染物的存在和晶体结构,这可能会严重降低性能的荧光、偏光显微镜。 完全复消色差校正,但是,仍然需要天然萤石和眼镜,在近紫外范围减少传输。 一个理想的妥协往往是半复消色差透镜或萤石的物镜,这是一个真正的多用途的物镜,很好的校正相结合具有良好的对比度,高数值孔径值,和高光谱的吞吐量。

尽管光胶的厚度平均只有约10微米或更小,水泥放双线或多个透镜元素之间的光谱吸收特性,有可能使一个物镜的不适合特定的应用程序。 在大多数情况下,化学和光学玻璃的光学性能,和光学水泥,通常是专有的。

在玻璃表面反射光线的空中接口和传输损失的结果,即使在没有光的吸收和光束垂直于界面的事件。 当入射角增加,增加的方式是依赖于光波的振动方向的定位和传输损耗的反射(垂直或平行于入射面)。 每个未空玻璃界面可以反映出四和百分之五个垂直于表面的入射光束之间(见图5)。 透光率每通过一个未经处理的接口将95到百分之96在正常的发病率。 通过应用 抗反射涂层 (通常是一个季度波干扰膜厚与适当的折射率),在玻璃表面的光反射可以在中等范围的波长和入射角度减少到百分之一或更少,在400和850纳米之间的波长范围内的5的数字说明。

多层减反射涂层已被开发,可以减少空气的玻璃界面的低的值,在更广泛的波长的百分之0.1反射。 大多数的常用的多层干涉膜稍有绿的色彩,与单层涂层的紫色色调,使它们更容易识别。 一些抗反射涂层,特别是多层的,行为的各向异性的非正常的入射波的偏振依赖性可以大大降低光学系统的消光系数。

作为物镜的复杂性的增加,更多的镜头的元素是必需的,这突出了需要消除内部反射产生更高的传输,更好的对比度,和更少的耀斑。 这些属性是特别重要的事件或反射光的应用。 单层抗反射涂层,可以追溯到20世纪40年代以来不断完善和补充的多层涂层,增加传输在可见光谱范围内通过空气的玻璃接口从百分之96左右(不包)到百分之99.9(利用多层涂层,如上所述,在图4和图5所示)。 图6说明了多次反射在玻璃表面的影响具有折射率(分别为1.5和1.8的上部和下部的图纸,)。 在较低的折射率(1.5),八个元素的16面,各反光约百分之四的入射光,在吞吐量只有百分之52的结果。 相反,高折射率玻璃元件(1.8),16的未涂覆的表面将只有百分之26的入射光。 单层减反射涂层增加了传输到百分之85,而多层涂层增加这个值约百分之94.6。 这增加的吞吐量和降低相应的内部的散射和噪声,大大提高了图像的对比度,因为它使光明和黑暗的颜色鲜明的特点。

涂层材料是氟化镁或大量的专有材料,它们都有自己的光学性质可能会影响在给定的光谱区域的光学系统的传输。 在一般情况下,抗反射涂层的干扰特性和频谱有限,在可见光范围内的高传输性干扰手段在谐波相关的频率在传输带的破坏性干扰。

大多数现代的高数值孔径的物镜具有高度的光学像差校正包含多达15个独立的镜头和多达10空玻璃界面。 如果镜头无涂层,反射损耗的轴射线单独将这些物镜的透光率约百分之50。 所有的表面涂层使用单层或多层干涉膜,透光率可提高到约86至百分之90。

除了这些透镜元素的发现物镜,有可能存在两个和四个的玻璃-空气界面之间在现代显微镜的光学系统

  • 灯箱和集 - 4-6个人透镜元件
  • 内部的光学列车 - 2-8镜,棱镜,和中继透镜
  • 滤波器 - 2-8单位在传输或免疫荧光
  • 分光镜 - 1-4单元观察管和摄像系统
  • 聚光镜- 4-8镜片,根据光学校正
  • 标本 - 0-4包括幻灯片和盖玻片
  • 目镜 - 4-6取决于光学校正设计
  • 摄像系统 - 2-6透镜,反射镜,和过滤器元件

在极端的情况下,可以有多达五个光纤接口时的物镜包括。 小于百分之9的轴向光将透过显微镜60无涂层的界面,和一个小的在所有百分之50面涂。

高质量透镜涂层是必不可少不仅通过显微镜提高了光的传输,但也降低由于在玻璃表面多次反射闪光。 然而,即使是最好的涂层不会超出一定波长范围内工作。 对于某些波长,涂层可以提高反射率(半波干涉膜是一种完美的反射器)。 这是一个重要的一点要记住,用CCD摄像机,数字成像的光电二极管,光电倍增管,或视频传感器,其中光检测器的灵敏度,能峰波长从人眼的相当远。

此外,反射损耗的光纤接口,通过光传输阻塞 灯套 可能会降低图像的亮度。 当灯的年龄,玻璃或石英护套可能开裂或使它成为devitrifies或涂或渗透的雾化金属从灯丝或电极蒸发。 值得注意的是,灯的透光率可能下降更快的夹克在紫外比可见光区域。 在这种情况下,可见光的亮度或亮度,用光度计测量,可能是汞或氙弧灯的紫外线输出一个贫穷的指标。

毛玻璃漫射屏只发送10到百分之15的光在其正常的百分之三。 不光是在斜入射角的传播。 因此,地面玻璃扩散器应避免在光照水平必须最大化。

过滤器和双色镜下有传输通带变窄。 许多干扰滤波器传输只有15到百分之30的入射能量在传输峰值波长。 然而,一些选定的多层干涉滤光器的一半的传输带宽窄作为50埃可以提供百分之75或更大的峰值透射率。

偏振滤光片偏振和微分干涉对比(DIC)光学也可以大大减少传输的光通过显微镜。 甚至当起偏器和检偏轴设置在峰值传输一个平行的位置,一个偏振滤波器组的透光率,每百分之20个自然光透过率,仅为百分之8。 相反的,高质量的 方解石棱镜 带防反射涂层盖板可以对入射的非偏振光的每双百分之50的最大理论。

图7给出了在现代光学显微镜用于传输和反射光的照明和观察内部透镜元件实例。 注意玻璃空中接口在镜座灯和透镜场和垂直照射类似数量之间的大量。 也有大量的接口在Windows,棱镜,和观察管和目镜的镜头,以及物镜转盘和聚光镜组件。

如上所述,多种因素可以通过现代显微镜的许多光学元件限制光传输。 其中一个是争取最高的分辨率,特别是在增强模式下的图像本质上是模糊的,所有前面列出的因素应仔细检查。 应当重申通过整个显微镜透射通过所有的光学元件的透射率确定产品。

照明亮度

在显微镜配备了一个很好的校正光源(包括聚光透镜系统)和聚光透镜,光照程度( 照度 )Kö柯勒照明条件下的场是由许多因素包括固有亮度(平均 光密度 )的光源和焦距为光源的聚光透镜的。 此外,的聚光透镜系统的数值孔径,孔径光阑的聚光镜的开口大小的设置,和整体 透光率 照明系统的帮助控制照明度。

Köhler照明下,光从一点发出的源均匀照亮的显微镜视场光阑产生明亮的均匀照明领域(取决于光源的性质)。 因此,在该领域的膜片的开口的大小只影响照明领域的直径而不是它的亮度。

所选光源发光密度
电流
(安培)
发光的
通量
(流明)
平均发光
密度(CD/mm 2
圆弧尺寸
(H×W)
(毫米)
汞灯
(100W)
5 2200 1700 0.25×0.25
氙灯
(75W)
5.4 850 400 0.25×0.50
氙灯
(500W)
30 9000 3500 0.30×0.30
卤钨灯 8 2800 45 4.2×2.3
表2

提供的聚光透镜焦距并非缩短项物镜源,包括聚光镜光圈整个打开一个图像,采集的电源,或 F 价值(直径/焦距)的镜头不影响现场照度。 该光源和聚光镜数值孔径的平方确定场地的照度平均光密度,提供电容虹膜开口中填充了光源的图像。 收集电力的聚光透镜和光源的大小影响场照度仅当源图像不会覆盖整个聚光镜孔径。

总之,平均光密度(每单位面积的光源的光输出)确定图像的亮度,而不是总的光输出量,光通量,或光源面积。 从光源光通量的光密度和源区的产品,后者只起到次要的角色,在确定的平均光密度。 由于源的发光密度限定范围的照度,图像的亮度不超过光源的光密度。 换句话说,现场不能比源明亮,无论多么聪明的安排和组合镜,棱镜,透镜,或其他部件的光学列车。 表2列出了几种照明光源,具有相对高的光密度,光学显微镜是有用的,包括规格如光通量的大小,弧,和平均光密度。

应当指出的是,许多集中(汞和氙弧灯)提供了一个非常高的程度的光密度,并在电弧的光分布极不均匀度。 通常,电弧是在相邻的一个电极点亮一分钟,即使在弧的整体尺寸小(0.3×0.3毫米低)。 当这样的电弧图像投影到聚光镜孔径,不再有照度均匀分布。 因此,在试样各点所产生的衍射图案偏离理想的通风盘。 然而,这些弧灯显微镜的某些应用程序是必不可少的(主要是因为高荧光) 的意思是 光密度。 这种情况的一个补救方法是采用一个单一的光学纤维(不是一个纤维束)光器可以添加到显微镜没有明显损失的平均照度。 图8说明了荧光图像的物镜后焦平面在一个情况下,现场照明不均匀,由于光照强度分布不均匀。 图8(a)标本的图像被均匀地照射,将项物镜一个可接受的图像到传感器。 相反,在图8(b),试样不正常照明整个视场,会导致在一个显着的程度的强度波动图像。

显微镜聚光器是在确定的质量和提供的照明度的一个关键要素的标本。 一些显微镜聚光镜可以采用无聚光镜顶部透镜和物镜前透镜之间的浸没介质。 更经常的,高质量的聚光镜设计用于与一个特定的浸没介质,具有特定的折射率和色散。 介质,可油,甘油,水,空气,使凝汽器顶部的透镜元件和试样的上下表面之间的空间。

多数暗视野,和一些相对比,微分干涉对比(DIC),和偏振光光学要求聚光镜是沉浸为了实现高凝汽器数值孔径。 凝汽器是专为最佳性能和最小像差时正确的浸泡介质具有定义的折射率和色散是利用。 浸泡省去了光的损失超过了临界角,消除了额外的折射,反射光的损失最小化,并减少光学接口,或反映在高入射角的散射光的数量。 这种散射和反射成为一个来源的火炬,并改变光的偏振状态,从而减少高数值孔径的光学系统中的偏振消光。 总之,聚光镜的浸没影响场照度以及图像的质量。 为了实现最佳性能,设计为沉浸式聚光镜应沉浸与正确的介质。

虽然该领域的照度与聚光镜的数值孔径的平方增加,打开聚光镜光圈太远物镜数值孔径的匹配产生耀斑。 此外,该照明,错过物镜孔部分产生的暗视场图像叠加在明场图像,从而降低图像的对比度。

结论

该地区暴露在一个视频传感器或胶片平面中的光学显微镜对放大率的平方成比例,如以上所讨论的。 因此,图像的亮度的减小放大广场。 在一般情况下,显微镜用于暴露的细节在一个标本,但与此同时,显微镜是一种有效的集光仪。 正如望远镜或双提高我在夜间的异象,显微镜的聚光能力,可以有效地捕捉照亮物体的影像。

根据样品必须是可视化的特点,图像可能会变得更加有意义,如果更多的光的收集,而不是提高放大倍数。 对于一些发光和荧光标本,光水平可能会很低,高度放大的图像变成看不见的或检测不到,因此毫无意义。 在这种情况下,图像可以通过集成的光在时间收集更多的光线,更清晰的(如果试样是静态的),或通过降低图像的放大率。

在非常低光水平的情况下,可以用最高的数值孔径物镜可在最低的总放大倍数最大化图像亮度。 在某些情况下,它是用眼去减少甚至是有益的,而不是增加,中间图像的放大倍率。

为了配合传感器分辨率的物镜分辨能力,有一个总的趋势,提高放大的图像投射到CCD传感器或视频摄像装置。 由于图像的亮度下降的放大和传感器方只能在限定范围内的强度函数,增加放大会导致亮度水平低于传感器的灵敏度。 如果试样被固定或变化非常缓慢,信噪比可以通过集成的图像在几个帧时间显着改善,通过求和或平均信号,或者更好的是,通过在传感器本身集成光电子。 在这种情况下,时间分辨率的提高空间信息的牺牲。 不管如何,往往有一个拔河,和妥协,试图提高分辨率并试图降低噪音水平之间的急剧上升,作为图像变得暗淡。 当亮度的图像是有限的,其技术人员必须仔细调整仪器放大取得最好的平衡。