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徕卡显微镜深层组织成像清除步骤

2014-09-20  发布者:admin 

为什么结算? 好奇心是人类的天性。 并没有什么吸引尽可能多的好奇心的生物体。 虽然在古代那些减少人体对做研究开放被处死,教皇克莱门特七世和现代解剖学开始后才允许解剖,我们现在可以看大脑工作生活的动物——有良好的机会很快就能够干扰治疗的观察活动(或控制)的目的。

 

图1:调查的深层结构躺在哺乳动物大脑没有机械切片,一个新颖的方法使用电泳组织清算,以减少光散射。 Non-sectioned Thy1-YFP小鼠脑组织清晰成像处理与新徕卡HC FLUOTAR L 25 x / 1.00 IMM motCORR VISIR目标共焦系统由徕卡微系统。 由卡尔Deisserroth Raju。托马,斯坦福大学,帕洛阿尔托,美国CA)。 
插入显示海马的三维多色图像。 EYFP(绿色),parvalbumin-positive神经元(红色),和GFAP(蓝色)。 许可麦克米伦出版社有限公司:自然497:332 - 37岁,2013年版权。

 

中世纪禁止打开人体——至少在小说——绕过了超人的特殊能力:x射线视力。 虽然已经有一些科学讨论这个话题,很明显,没有办法通过不透明材料的可见光。 观察组织生活的材料,如通过颅窗大脑,不允许我们内心深处,散射和吸收仍然发生在大脑组织。 作为一个选项固定材料,各种协议的“清算”提出了在显微镜的历史。 这些协议旨在减少散射和消除吸收物质。

结算方法

经典的“电镀”在微观化学准备协议,如氢氧化钾和乳酸,化学修改的组织。 尤其是chitin-containing对象受益于这样的待遇。 丁香油也被用来制造组织透明,很容易与加拿大香油和混相类似的折射率(1.54)。 除了漂白吸收分子,在成像厚生物对象的主要问题是散射,这发生在许多的边界改变折射率(图2 b和c)的光去旅游。 因此,结算方法的主要任务是“平衡”折射率不破坏的三维结构和没有退化,可能现在的荧光染料。

图2:通过吸收颜料)低透明度;b)低透明度将有效散射表面折射率变化;c)高透明度均衡后的折射率。

 

一个选择减少折射率变化组织是删除水和取代它的有机化合物有更高的折射率。 只要100年前,Spalteholz描述这样一种治疗苯甲醇和水杨酸甲酯。 他建议,最后安装解决方案必须有相同的折射率的平均指数干的材料。 许多衍生过程一直以来发表,主要不同化学品应用(包括丁香油)。 所有这些协议有两个常见的步骤:首先“干”的示例通过孵化与增加浓度的乙醇或四氢呋喃等,然后用高指数补充溶剂甘油、苯甲酸苄alcohol-benzyl(巴伯)或二苄基醚(DBE)。 磷酸后是不可能这样的处理和结算之前必须应用。 荧光染料不太稳定,成像后应尽快进行清理。 对于大多数食谱,样例在治疗通常会收缩,这表明三维结构一致性可能部分丢失。

类似的方法试图增加水的折射率阶段通过添加水溶性化合物,如葡萄糖,果糖(SeeDB)或尿素(规模)。 在这种情况下,样品不需要干燥。 体积的变化依赖于方法,可以低(SeeDB)或大(规模)。 由于高渗透性,材料可能扩大1.5倍,沿着一个轴。 的扩张可能是一个重大贡献更高的透明度。 为了看远方进入组织,扩大样本是适得其反,自由工作距离物镜的成像深度的限制。 如果一个样本扩大1.6倍,有效最大成像深度降低38%。

三分之一的方式减少折射率变化来取代水极性溶剂(n = 1.33)的高折射率,ClearT使用孵化与甲酰胺(n = 1.45)。 这个过程不会改变音量太明显,让亲脂性的示踪染料成像,由于协议不使用洗涤剂,破坏膜结构。 变体添加聚乙二醇,保护绿色荧光蛋白从解体和因此产生更好的信号与荧光蛋白样品标签。

Pellucidation过程

在他的书中,Spalteholz使用的术语“DAS Durchsichtigmachen” - 一个陌生的词,即使是德国人。这是比“清算”更具体,因为它的字面意思是“pellucidation”,即“做透明” - 当然,不破坏空间结构。为了实现这一目标,通过一种完全不同的方法,该集团卡尔戴瑟罗特的着手开发新的程序,真正使大脑透明不破坏蛋白质的组装,并采用串行immunostainings调查的网状组织功能的分子排列的选项。他们称他们的方法,净度。 

正如上面提到的,闹事的深成像是脂质。大脑的membranome为苏摩膜,轴突和树突状管,核信封,房室膜和突触结构的复杂和密集堆积砾岩。非常有效的散射体 - - 移动大约在所有细胞上的顶端,这个集合是由囊泡数量庞大的加冕。所有这些膜的工作是为了保持结构的完整性,并分离各隔室中。只需添加清洁剂会溶解膜结构和转换的大脑了接近原始汤。 

 

因此,在净度协议(图3)的第一个步骤是一个过程,销的蛋白到其三维坐标 - 不依赖于膜结构。为此目的,一个整体(麻醉)动物被灌注的单体,用于生产水凝胶,经典的丙烯酰胺和交联剂(甲醛)。甲醛将共价结合到蛋白质和其它生物分子,这是它的经典功能作为固定剂。它也将交联的水凝胶的单体的生物分子,但不是脂质。该解决方案还包含一个热引发剂。经过彻底灌注在低温下,将温度升高到37℃。加入的热引发剂开始聚合反应,生成的水凝胶 - 就像任何酰胺凝胶。大部分蛋白质成为三维网状,这是因此称为混合凝胶的一部分。这是怎样的蛋白质被固定到其在体内的位置。

图3:a)与膜生物组织(厚的黑色线条)支持蛋白质的空间分布(彩色)。 b)与聚合物组件灌注后,水凝胶的蛋白质固定(薄蓝线)与交联(蓝点)。 c)膜切除后,组织是透明的,甚至渗透大分子,如抗体和荧光染料。 他们体内的蛋白质和其他生物分子固定坐标。

 

在第二步中,大脑是孵化与SDS的解决方案。 洗涤剂溶解膜和形成胶团。 水凝胶,包括生物分子——不受影响。 加快这个清算过程,除去微粒加速了电泳,因此这个过程被称为电泳组织清算(等)-脂质是大脑的电吸出。 剩下的结构是一个membrane-free水凝胶包含大部分的蛋白质在原来的位置。 水凝胶的光学性质完全改变:高度透明(软性隐形眼镜是由水凝胶)和折射率是相对均匀的整个大脑。 因此,散射是接近于零,组织是透明的。

整个过程是非常友好的荧光蛋白。 如果动物包含一个或一系列的荧光蛋白,清除组织将呈现这些蛋白质在原来的位置,和荧光是不灭的。(这是一个问题在巴伯准备,规模和部分协议)。 样品不仅是透明的,但也允许大分子的扩散层深处。 串行磷酸与一组不同颜色的荧光染料可用整个大脑。 这是大脑结构映射的关键项目和类似的研究任务。 亲脂性的示踪染料,如DiI,当然不会使用lipid-free样本(除非使用染料,可以交联水凝胶)。

光学符合

图4:新开发的HC FLUOTAR L 25 x / 1.00 IMM(n = 1.457)motCORR VISIR目标标本处理清晰。

样品准备好清晰的方法可能与所有荧光的荧光成像技术,最好是用共焦显微镜,提供所需的高轴向分辨率。 镜片应该有一个足够长的工作距离允许集中通过大脑没有机械切片。 脑映射,视野应该大,为了记录完整的大脑尽可能几瓦的水平。 所需的空间分辨率要求高数值孔径,和多通道多光子成像需要高性能的蓝色至近红外光谱范围。 所有这些参数正确的关键甚至几毫米的深度是一个控制的光学路径长度,即校正领镜头,使其适应不同的折射率。

徕卡推出这样一个镜头:HC FLUOTAR L 25 x / 1.00 IMM(n = 1.457)motCORR VISIR。 这个镜头提供了22毫米的视野在25倍放大,即场近1×1毫米。 横向分辨率是250海里的蓝绿色光,和自由工作距离是6毫米。 这是足以示例12毫米厚度的对象,当了一次。 镜头有很高的透过率从470纳米到1200纳米,这是专为样品折射率在1.45。 修正领机动和批软件控制,这使得自动校正而聚焦在样品不同位置。