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徕卡显微镜STED样品制备与快速指南

2014-09-16  发布者:admin 

本指南的目的是作为一个快速参考指南最常见问题关于样品的准备徕卡SP8 TCS发生的3倍,通过介绍所需的理论基础 样本受激发射损耗 。 它提供了最常见的信息免疫荧光标记技术 越来越多的媒体工作 基本质量优化程序 和 实验设计 。 它还包含一个详细的列表,试剂、抗体和一次性用品经常成功地用于超分辨率发生的显微镜。 总之,本指南是为了现在的必要的知识,包括一些提示和技巧,为用户准备他们的第一个超分辨率显微镜样品。

 

指导的重点设置 Leica TCS SP8 STED 3X 与592 and 660nm STED激光

受激发射损耗(STED)显微镜是基于荧光共焦成像,其中图像是通过扫描形成聚焦光点在感兴趣的区域,并且通过像素收集的荧光顺序像素获得的超分辨率方法。该技术的主要优势有:

  1. 横向分辨率没有任何额外的后处理低于50 nm涡流环室
  2. 内在的共焦光学切片,用涡甜甜圈时,使收购约500纳米的平面,三维结构,甚至几十微米深层组织内的
  3. 使用z轴分辨率低于130 nm甜甜圈
  4. 到水平和分辨率提高空间分布于感兴趣的样品/应用单独匹配的能力
  5. 每秒几个图像的快速图像采集
  6. 通过使用荧光蛋白或其他荧光标记活的成像能力
  7. 能够选择的荧光在很宽的光谱范围由几个不同的激光器受激发射损耗在一台仪器启用

步骤1:选择样本

  • 受激发射损耗可以在一个大的各种样品的应用,从单一培养的扁平细胞,组织切片,以整体动物,如线虫(线虫)和昆虫(果蝇)。尽管如此几点应该加以考虑。受激发射损耗应用专门开发的受激发射损耗100X /1.4油浸物镜,其中有90微米的工作距离。因此,所观察到的结构应该是至多80微米远离护罩玻璃,但优选在20μm的范围内以获得最佳性能。另外,为了达到最佳的效果,在安装介质的折射率应当与所使用的浸没的索引(浸渍液=1.518,也见步骤5)。目前在我们的投资组合干浸的物镜。
  • 该结构必须是光学上可访问的。自发荧光,折射率的突然和不可预测的变化(如含有空气,髓鞘和脂肪组织)可影响焦斑的形状和显微镜的结果的性能。如果与结算解决方案的经验是可用的,它可能是值得的测试。
  • 在STED成像,样品在592纳米或660纳米的波长照射强光。这是该试样没有在这些波长处吸收光至关重要。

步骤2:选择荧光团

有一个广泛的徕卡STED显微镜表现良好的荧光基团(如见附录A)。为了达到几个小时,在这一个系统示范正常范围内实现了令人满意的结果,最好是留在荧光徕卡提出的保留节目。如果这是不可能的,荧光团应选择,它们具有相似的激发和发射光谱的建议染料。这也有利于入手单色染色和,一旦这些被批准,转移到多色实验。请参阅附录B和C的推荐荧光体组合多色实验,它不需要额外的光谱分离。对于受激发射损耗,以提高工作效率,无论是荧光的发射光谱需要显示的受激发射损耗波长显著发射(见例之星440SX和俄勒冈绿488在下面的图)。

为了使染料和类似的排放不同激发的光谱分离是必需的。为受激发射损耗与592纳米,这是通过使用大的斯托克斯位移染料(BD V500,STAR440SX,STAR470SX)与位于更远的频谱的左边吸收光谱,比常规染料的吸收光谱常常实现。 

它主要是能够包括额外的染料为更多的颜色。门控受激发射损耗技术使染料与可敬的决议(显著低于80纳米)的受激发射损耗相同波长的显著不太严格的选择。这最终使得与592线受激发射损耗(如星440SX,俄勒冈绿488和Alexa Fluor532)三色标记成像。门控受激发射损耗三色成像三个标准染料与660激光受激发射损耗(如Alexa的488,将Alexa Fluor532和TMR)的实现。 

STED显微镜提供了最可靠的超分辨共定位数据。受激发射损耗甜甜圈/行确定的荧光可以被去除,因此该通道可以被视为本质上一致。当然,人们也可以依次用几个STED行工作,以达到最佳的可能的解决方案对于给定的荧光团,但对于完美的共定位数据,这可能需要修正,因为它们是为其他的超分辨率技术必需为好。 

另外其他的荧光标记物可被用作counterstainings用共聚焦分辨率。这些染料的发射,然而,应该驻留的受激发射损耗检测的范围,能够以其他方式与STED图像质量干扰之外。此外,它很可能是这些染料将吸收强STED消耗光并得到漂白。因此,所有的参照图像应受激发射损耗图像之前被收购。 

注意,使用DAPI和Hoechst公司可能对图像质量(背景)有负面影响,特别是与592毫微米STED耗尽激光。

 

步骤3:选择主要抗体/标签的结构

为了分析给定样品中的受激发射损耗的性能,该试验被最佳地划分成两部分。 A部分和B可能并行执行,其中A为对照实验二

A) 在根据环境评价的STED性能
荧光染料和抗体是明智的周围环境(pH值,盐浓度,氧化还原试剂)。为了从给定的样品检查染料的性能,在第一步骤中,一个完善的初级抗体,应选择,给出了一个具体的,明亮的染色。即使没有实际的生物相关性,此步骤有助于确保将染料按预期在周围环境中。

B)与所述感兴趣结构工作 

在第二步骤中,在技术上更为苛刻染色可以成像,现在针对所感兴趣的实际结构。 

标记密度起着超分辨率重要的作用,但它不能被正确地与常规的显微镜检查。通常,在染色过程中,增加抗体浓度已有助于提高样品质量。因此,建议具有较高的抗体浓度(2〜5倍)的受激发射损耗成像合作,以确保最佳标记密度。 

明智的做法是测试不同的小学和中学染料浓度在步骤A和B染色的质量(亮度/背景),应检查并有可能使用之前STED成像传统的显微镜进行了优化。

步骤4:例如抗体染色

警告

有害物质

预防措施来保护你,其他人与环境

在抗体染色程序执行的每个动作对样品的质量有显着影响。每个步骤将细胞培养用标准免疫荧光协议的方式来简单地说明,作为一个例子中的最优化步骤为他/她自己的协议,以帮助用户:

试剂 
 •磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH值7.4
• 在PBS中的2%多聚甲醛(PFA)
• 1% Triton的PBS
• 牛血清白蛋白(BSA)

过程 
所有的步骤都是在室温下进行,评论是在括号中。

  1. 冲洗3次,用PBS
    (细胞应洗涤,培养基由几次漂洗培养除去。组织应解剖并从部件可能妨碍图像采集洗净,用建立的实验室协议,如果它们是已知的工作。样品必须轻轻地和快速地处理,这本来会导致过早死亡和分解。)
  2. 在PBS中进行15分钟固定与2% PFA
    (样品固定在样品制备中的关键步骤,因为它定义了如何很好的结构将被保留。随着分辨率这个步骤变得更加重要,应小心处理。PFA是一种常见的固色剂,但它并不总是表现最佳之一。这里可能需要一些研究在文献和优化。替代地,温育5分钟,用冰冷的(-20℃)100%甲醇中可以使用的甲醇固定不需要额外的通透性的步骤,因此,步骤5和6可以用甲醇固定被忽略,也参见下文)。
  3. 冲洗3次,用PBS
    (删除更高浓度的固定液为以下步骤)。
  4. 与PBS洗涤3次进行5分钟
    (删除其余的固定液以下步骤)。
  5.  在PBS 10分钟通透与0.1%的Triton
    (关键步骤以显示表位的第一抗体。较低浓度/短的孵育时间可更好地保持了结构,但妥协标记密度,较高的浓度/较长的孵育时间可能使表位更容易获得的抗体,但也恶化的结构。某些固定剂(如甲醇),不需要额外的通透步骤。)
  6. 与PBS冲洗3倍 
    (去除渗透剂。)
  7. 在PBS中的2%BSA的1小时
    (阻断可以用不同的试剂来进行,通常由结合于非特异性结合伴侣,否则将结合的抗体与增加的荧光染料的非特异性标记的惰性蛋白质,也是最好用封端剂而与抗体孵育作为血清有助于保持细胞结构,较厚的组织,可能需要较长的培养时间。)
  8. 孵化与第一抗体进行1小时 
    (用较高的抗体浓度可能是受激发射损耗试验很有帮助,潜伏期较长时间经常给出更好的结果,但要注意可能增加的背景下,在较厚的样品(如全坐骑)潜伏期可能长达几天,或者潜伏期可以做到在4℃下过夜)。
  9. 与PBS洗涤3次进行5分钟
    (洗涤步骤是重要的,使用高浓度的抗体,尤其是当5分钟为单位的绝对最小的洗涤步骤,在这里,否则转移到10或20分钟的孵育和更多次获得更好的结果上漂洗步骤可能加快该过程。)
  10. 孵化与二次抗体进行1小时 
    (您可能需要采用/优化抗体浓度为您的应用孵化与二次抗体应该进行类似的一抗孵育二抗一个良好的起点是1稀释:100,从商业来源的时候买的,否则,5×比推荐的稀释更高对于贝克顿迪金森和V500染色使用生物素化的抗体从杰克逊免疫研究实验室以1稀释度:100在这个步骤中温育,也可以一蹴而就较厚的组织需要较长的培养时间)。
  11. 与PBS洗涤3次进行5分钟
    (删除 
    从样本的抗体。 更长、更洗步骤将提高质量和特异性的荧光标签。 以前的清洗步骤可能加速这一过程。)
  12. 额外的步骤只需要与BD V500染色时: 
    •孵化与Streptavidin-V500 30分钟 
    (额外的步骤当BD V500用于荧光标记。 稀释的V500应该1:50。 可能需要更长时间孵化项目心脏组织。) 
    •清洗与PBS 3 x 5分钟 
    (删除释放Streptavidin-V500从样本。 更长、更洗步骤将提高质量和特异性的荧光标签。 以前的清洗步骤可能加快进程。)
  13. 安装
    (见下面的步骤5)
  14. 存储在4°C

最后,染色应该清晰和明亮,当通过目镜观察时(如592年发生的:GFP设置单一的颜色,或CFP / YFP设置双颜色与标准和大斯托克斯位移染料)和产量好信号噪声在共聚焦或宽视场荧光显微镜。

第五步:安装

该安装介质应具有的折射率匹配,以使最高穿透深度没有令人不快的畸变所要求的目标的浸渍。此外,没有自发荧光应与592纳米或660纳米的激光照射时,可以观察到,也不应含有DAPI或Hoechst公司(为592毫微米STED)。或者,如果DNA /细胞核染色要求,PicoGreen(Invitrogen)中被发现与两个592纳米和660纳米STED表现良好。 

在某些情况下,安装的介质影响的大的斯托克斯位移染料的荧光量子产率(例如的Vectashield),或荧光蛋白和一些绿色染料(如TDE - 染料在TDE工作请参阅施陶特等人的列表,2007)。因此,我们不与大Stoke's移染料推荐的Vectashield的利用起来。延长黄金(Invitrogen公司)也表现良好在我们的手中,并建议由徕卡。 

非常良好的结果也与相当简单的自制甘油基于安装获得如下所述:

  1. 甘油 
    通过结合不同数量的水(PBS)和甘油(甚至只是纯甘油)折射率(RI)可以精确调整在1.33和1.47之间。 此外,它很容易准备,适合长样本存储在-20°C。
  2. Mowiol 
    6克的甘油(分析纯),加入2.4克Mowiol粉(Calbiochem # 475904),6毫升水的桌子,12毫升0.2三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值8和搅拌大约4小时的解决方案。 随后让解决方案其他额外的2小时。 孵化Mowiol 10分钟50°C(水浴)和离心机的解决方案在5000克15分钟。 最后,把上层的冻结存储介质在-20°C。 Mowiol是迄今为止最适合介质发生的图像,可用于-20°C存储的样本。

所有徕卡物镜与盖玻片校正修正为1.5 #盖玻片(优:0.170±0.01毫米厚,Hecht-Assistent,猫。 1014/2424),数量应该用于安装和大大提高图像质量而发生的# 1盖玻片不仅也为共焦成像。

常见的不变色,例如DABCO(2.5%)或核计划组(4%),也可能导致重大改变所使用的染料和有时photo-physical属性发生的。

第六步:实时成像

徕卡TCS SP8 STED3X模块目前仅支持倒置显微镜代表和现场成像程序,必须做相应的调整。良好的结果已经报告了一系列荧光蛋白。

荧光蛋白

激发(nm)

损耗(nm)

mTurquoise2

434

592

eGFP

484

592

EmGFP (Emerald)

487

592

mNeonGreen

506

592

eYFP

514

592/660

Venus

515

592/660

mCitrine

516

592/660

dsRed

558

660

mStrawberry

574

660

 

但是,用于标记活体细胞(如微管蛋白跟踪绿,俄勒冈绿BABTA)也有机染料是有说服力的。 

如果实时成像实验需要的话,最好是直接从徕卡人员以澄清的实验步骤,并且如果必要的设备出现在现场。

 

附录A:合物进行染色的名单

 

荧光团

激发 (nm)

消耗 (nm)

提供者

Cat. number

Biotinylated Antibody

Jackson Immunoresearch

115-065-003 (老鼠)
111-065-003 (兔子)

BD Horizon V500**

458/470

592

Beckton & Dickinson

561419 (Streptavidin)

Abberior STAR 440SX**

458/470

592

Abberior

2-0002-003-7 (老鼠)
2-0012-003-4 (兔子)

ATTO 488

488

592

Sigma-Aldrich

62197 (老鼠)
18772 (兔子)

Abberior STAR 488*

488

592

Abberior

2-0002-006-8 (老鼠)
2-0012-006-5 (兔子)

Alexa Fluor 488*

488

592

life technologies

A11001 (老鼠)
A11008 (兔子)

Chromeo 488*

488

592

Active Motif

15051 (老鼠)
15061 (兔子)

FITC

488

592

Sigma-Aldrich

F0257 (老鼠)
F0382 (兔子)

DyLight 488*

488

592

Thermo Scientific

35502 (老鼠)
35552 (兔子)

Chromeo 505**

488/514

592

Active Motif

15050 (老鼠)
15060 (兔子)

Oregon Green 488**

488/514

592

life technologies

06380 (老鼠)
06381 (兔子)

Abberior STAR 470SX**

470

660

Abberior

2-0002-004-4 (老鼠)
2-0012-004-1 (兔子)

Alexa Fluor 514**+

514

592/660

life technologies

A31555 (老鼠)
A31558 (兔子)

Alexa Fluor 532**+

532

592/660

life technologies

A11002 (老鼠)
A11009 (兔子)

Alexa Fluor 546**

546

660

life technologies

A11030 (老鼠)
A11035 (兔子)

Cy3**

550

660

life technologies

A10521 (老鼠)
A10520 (兔子)

Tetramethylrhodamine/TRITC**

554

660

life technologies

A16071 (老鼠)
T2769 (兔子)

Alexa Fluor 555**

555

660

life technologies

A21424 (老鼠)
A21429 (兔子)

CF 555*

550

660

Biotium Inc.

20031 (老鼠)
20032 (兔子)

Alexa Fluor 568**+

568

660

life technologies

A11004 (老鼠)
A11011 (兔子)

Alexa Fluor 594**+

594

660

life technologies

A11032 (老鼠)
A11037 (兔子)

 附录A:报道与徕卡STED显微镜工作的一些结合物的清单。
* 推荐染料单色实验;
* *推荐染料单、双和三色实验。 
可能需要先进的成像参数设置,由于较高的抗中风的激励,如小针孔,受激发射损耗低激光功率和高门启动值。

 

附录B:推荐双颜色染料组合单发生的激光线*

STED592nm ,660nm

染料1

染料2

名字

激发

发射:例如

的名字

激发

发射:例如

BD Horizon V500

485/470

475 - 510

Oregon Green 488/Chromeo 505

514/520

523 - 580

Abberior STAR 440SX

458/470

475 - 515

Oregon Green 488/Chromeo 505

514/520

523 - 580

Alexa Fluor 532

514年

520 - 565

TMR/TRITC/Alexa Fluor 568

580

590 - 650

Chromeo 505

505年

515 - 565

TMR/TRITC/Alexa Fluor 568

580

590 - 650


*染料的光谱可能转向,由于环境条件,结合型和样品的年龄。我可能需要最佳光谱分离的激励线和检测范围略有调整。原则上,建议的染料进行了测试,发现没有或通道之间只有很小的交叉谈判。

附录C:推荐三色染料组合,单个和多个受激发射损耗的激光线*

STED592nm ,660nm

染料1

染料2

染料3

名字

激发

发射

名字

激发

发射

名字

激发

发射

STAR 440 SX**

470

475 - 505

Oregon Green 488

510

515 - 530

Alexa Fluor 532

540

550 - 585

Oregon Green 488**

470

475 - 525

Alexa Fluor 532

532

538 - 550

TMR/TRITC

580

590 - 650

Alexa Fluor 514**

480

490 - 535

Alexa Fluor 546

540

545 - 580

Alexa Fluor 594

590

600 - 650


* 染料的光谱可能转向,由于环境条件,结合型和样品的年龄。我可能需要最佳光谱分离的激励线和检测范围略有调整。原则上,建议的染料进行了测试,发现没有或通道之间只有很小的交叉谈判。
* *多色图像可以通过使用嵌合STED只有激光或两者STED激光器帧获取/依次堆叠