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奥林巴斯显微镜共聚焦显微镜光谱流通中的工件

2014-09-05  发布者:admin 

  流通(通常被称为 交叉 串扰 )的荧光发射,由于很宽的带宽和非对称谱形的许多常见的荧光团的表现,是一个根本的问题,必须解决两个宽视场和激光扫描共聚焦荧光显微镜。 这种现象通常表现为一个荧光团在光电倍增管通道或通过滤波器组合保留第二荧光检测的发射。流通 通过工件通常的解释复杂的实验结果,特别是如果荧光团的亚细胞共定位是调查或定量测量是必要的,如在共振能量转移( 烦恼的 )和光漂白( FRAP )的案例。

成像的标本有两个或两个以上的荧光标签(或植物组织切片表现出高度的自发荧光)常并发流通或交叉的荧光发射,除非这两个荧光基团的光谱分布是非常良好的分离。 例如,当双标记与传统的绿色和红色的探针,荧光素和罗丹明流通通过,只能通过使用滤波器组的优化荧光减少(和/或光电倍增管检测器狭缝宽度),但是不能完全消除。 这种效果是由于这样的事实,这些染料有很宽的吸收和发射光谱表现出相当程度的重叠。 因此,利用氩离子激光488纳米的荧光激发光谱线会产生激发罗丹明,虽然在较小的程度。 此外,荧光发射将被检测的光电倍增管通道或域滤波器组保留罗丹明。

光谱泄放通过在小鼠小肠和Cy3标记的Alexa Fluor 488个薄片(花青染料),和成像激光扫描共聚焦显微镜具有可调节的光电倍增管缝,如图1所示。 这些荧光表现出的吸收和发射光谱相似的荧光素和罗丹明,虽然略有不同的峰值波长和稍微窄的带宽。 图片说明的数字1对(一)和1(b)得到了同时横向扫描标本采用氩离子激光(488纳米;图1(a))和一个绿色的氦氖激光(543纳米;图1(b))。 注意的Alexa Fluor 488荧光渗漏明显在Cy3检测通道(图1(b)),这表现在最终的融合图像的重叠区域的黄色(图1(c))。 这件神器可以很容易地与荧光共定位的困惑。 通过依次扫描标本用单个激光器和荧光检测每个通道与激光照明(图1(d)和1(E);在下面更详细地讨论),光谱泄放通过最小化(比较图1(c)图1(f))产生一个更准确的合并图像的荧光分布。

Alexa Fluor 488检测通道(见图1(a)和1(d))的光电倍增管的狭缝被设置为30纳米的带宽(从500到530纳米),包括原发性探针的发射峰,但不捕获的Cy3荧光发射大量。 作为一个结果,的Alexa Fluor 488通道不在正常的电压增益设置检测Cy3荧光发射,无论是仪器扫描同时或顺序。 相反,从菁染料捕获足够的荧光发射,Cy3标记检测通道光电倍增管缝必须设置为一个更广泛的范围内(555至625纳米),这也允许的Alexa Fluor 488发射的波长较长,在检测器寄存器。 因此,调整检测器狭缝(或干扰滤波器)不足以充分减少流通有高程度的重叠荧光光谱。 在许多情况下,流通可以通过明智的选择的荧光团的吸收和发射光谱具有很好的分离。 用Alexa Fluor 568(Cy3在这个实例中的发光峰值波长35纳米的差异)会导致与氦氖激光激发效率稍低,但能显著降低流通。

一个比较的光谱重叠的一系列的Alexa Fluor染料组合的双色标记实验可能有用,如图2所示。 所有的发射光谱进行归一化处理,比较,和重叠的区域是由灰色阴影表示。 图2(a),为绿色荧光的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555橙黄色荧光发射光谱表明峰值波长分离清楚,也容易被人眼识别。 然而,频谱重叠的中等水平(灰色阴影区)表明,有相当数量的排放的Alexa Fluor 488在Alexa Fluor 555的峰值发射波长(由一个黑色的线运行,从发射峰横坐标表示)。 这种高水平的信号流通使探针的困难在哪儿的Alexa Fluor 488的荧光发射强度显著高于Alexa Fluor 555的情况下分离,可由于一些因素,包括标签的目标人群发生大的差异。 这些探头是由488纳米和543纳米的光谱线的氩离子和绿色的氦氖激光器有效激发,分别。

Alexa Fluor探针下降之间的光谱重叠的发射最大值的增加之间的带宽,如图2所示(B)。 在这种情况下,的Alexa Fluor 488和橙色荧光的Alexa Fluor 594展示了一个减少重叠的水平相比,图2(一)。 两种染料是很容易区分,对人的眼睛和光谱重叠程度低,应以最小的好成绩排在双标记实验,提供每个探针的浓度的样品是相似的。 Alexa Fluor 594是最有效的一个氪氩激光或黄色的氦氖激光器的594纳米线的568纳米线的兴奋。 或许在可见光发光的Alexa Fluor染料的最佳光谱分离的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 633描绘在图2(c)的比较。 几乎没有任何的光谱重叠之间的这些染料和流通通过工件应该是不存在的,即使在含有过量的Alexa Fluor 488例。 Alexa Fluor 633探针是由红色的氦氖激光或氪氩激光647纳米线的633纳米的光谱线的有效激励。

在描述的光谱重叠的工件,条款 流通 交叉 ,和 串扰 经常互换。 虽然流通和交叉引用的荧光发射的溢出(或兴奋)从一个滤波器组或光电倍增管检测通道到另一个,串扰是广泛应用于过滤行业描述最低衰减水平放置两滤波器串联在一起的。 一个固定的滤波器组合的串扰值为制造商匹配时,荧光激发,发射是非常重要的,和一套双色分光镜的过滤器,但有点不同于光谱泄放通过共聚焦显微镜。 因此,应小心使用选择项从一个检测器通道到另一个描述的荧光发射的重叠,和研究者应该认识到不同的术语。

光谱交叉可以激发和合成的荧光和荧光蛋白质通常利用共聚焦显微镜发射过程中发生的。 在一般情况下,荧光吸收之间的交叉(或兴奋)光谱谱线发生向蓝端(短波长)的频谱,而荧光发射光谱之间的交叉发生在红(长波长)区。 例如,从一个绿色的荧光发射的红光发射滤波器通常可以通过检测,但红色染料是只有很少的成像通过绿色发射滤波器。 这是由于这样的事实,和发射光谱的染料不均匀的吸收,但通常显示长,倾斜的尾部,覆盖地区的几十到几百纳米的。 吸收光谱一般都倾向于较短的波长,而偏向于较长波长的发射光谱。 为此,多色荧光成像应与红了(长波长峰值发射)染料成像第一,使用的激发波长,只有最低限度的吸收光谱的蓝染料的倾斜,尾巴。

样品标签的预防措施,减少流通

确定的物理和空间位置,以及生物分子和感兴趣的亚细胞结构之间的关联,标记标本与两个或两个以上的探针在荧光显微镜是一种非常有效的技术。 在这方面,激光共聚焦显微镜(当使用两个或两个以上的激光器)非常适合于多标记技术由于区分个别荧光团的荧光发射光谱之间通过引导信号检测能力的几个途径。 有,然而,众多的限制,必须在执行多个标记实验认为,无论是传统的广角荧光显微镜和激光共聚焦或。

常用的荧光团的荧光发射光谱有明显不同的关于带宽,峰值发射波长,对称性,和数量的最大值。 在多标记的标本,如果标签和从荧光团的荧光发射强度不均衡度,明亮的信号可以压倒和渗透屏障滤光通道保留较弱的荧光团或那些不太丰富的物镜。 结果往往是从overstained荧光记录保留一个低强度的探索频道形象的重大贡献。 从探针如荧光素和罗丹明荧光强度(以及他们的亲属)应该是相似的,根据试样中的染料量和照明光源的调整。 例如,在相同浓度下,罗丹明兴奋比在广角荧光眼底更有效(由一个因子10)由于在汞电弧光谱明亮的546纳米的发射线。

荧光发射不小心被过分强调在试样的制备。 在成像过程中,表观平衡可以通过改变增益,光电倍增管电压调整,或在激光共聚焦显微镜或通过广角荧光灯中电弧放电的中性密度过滤器使用单独的检测通道的激光功率。 然而,简单的平衡与目标数量的荧光量和颜色在试样制备将减轻许多问题时,成像和,在一般情况下,导致较高的图像。 这个概念是在图3中用荧光素和罗丹明双标签的情况说明(仅给出的荧光发射光谱)。 每个检测通道窗口列出了一个彩色的盒子在图3中,用荧光通道采集信号490和555纳米之间(红色框)和罗丹明通道设置范围为570到665毫微米(蓝箱)。 请注意,罗丹明信道具有显着更广泛的为了从倾斜的长波长的尾部区域的发射光谱采集信号带宽。

如果荧光团浓度是平衡的,这两个荧光基团产生类似的发射强度,再流通量从一个通道到另一个显示为灰色区域重叠的标记 1 2 图3。 显然,一个显着较高的荧光发射水平跨入罗丹明通道比反之亦然。 程度的流通可以减少,在这种情况下,通过降低荧光素的浓度保持恒定,罗丹明。 在这种情况下,荧光素标记的水平大大超过了罗丹明,流通量及通过越来越严重的地区,由标记重叠的增加说明 3 4 (注意,荧光素的浓度增加一倍,三倍,分别)。 在最高的荧光素浓度图3所示,通过排放量(面积流通 4 )在罗丹明渠道收集了几乎等于该目标的荧光发射本身。

当选择多标记样品的荧光探针,最聪明和最耐光荧光基团应保留最丰富的靶细胞。 一般来说,绿色和红色的荧光染料往往要比那些在蓝光和远红光的部分频谱。 然而,即使当探针浓度对量子产率,光,照明源和目标数量,严格控制,信号的电平交叉和流通通常是10和百分之15之间除非发射光谱最大值由100至150纳米以上的分离。 此外,局部环境的荧光团的吸收和发射光谱分布有显著的影响,所以光谱的荧光基团在溶液中分离的厂商发表会显著不同于实际的实验条件下观察到的。 在涉及两个或两个以上的荧光实验,应始终使用过滤器设置保证水平的流通通过其他荧光染色标本的检查单是最小的控制。 在许多情况下,主要的原因是不流通通过染色的荧光基团,可通过改变染色协议而不是调整曝光时间在显微镜下或在收购后处理图像的校正进行广泛的康复。

对荧光团的发射分离的仪器方法

传统的荧光素和罗丹明荧光团,连同他们的Alexa Fluor和菁染料的亲戚,是在广角和共聚焦荧光显微镜的双标记流行组合。 事实上,荧光素和罗丹明探针已广泛使用,大多数显微镜和售后过滤器的厂家有专门的过滤集命名后,他们的反应异硫氰酸酯中间体( 异硫氰酸荧光素 TRITC ,分别)。 宽视场显微镜配备了电弧放电激发这些荧光灯一般使用495和546纳米的光谱峰从汞的燃烧器,而现代的共聚焦显微镜采用氩离子激光488纳米的光谱线和绿色的氦氖激光器的543纳米线。

荧光素和罗丹明的荧光基团结合,然而,往往产生小于激光共聚焦显微镜,只配备一个氩或氪氩激光优化结果,既不发射波长适当的谱线(在530和560纳米)对罗丹明类荧光团的最有效的激励。 相反,吸收峰在较长的波长的荧光团居住,如Alexa Fluor 568,Alexa Fluor 594,或德克萨斯红(578,590,和596纳米的吸收峰,分别)应采用氪氩激光。 在某些情况下,配备了多线氩离子激光显微镜是用来激发荧光和与488和514纳米线的罗丹明衍生物。 然而,只有荧光素及其衍生物在488纳米的有效激发,最具有高度倾斜发射的尾巴,表现出明显的重叠与罗丹明类探针的发射光谱。 此外,在514纳米,荧光素和罗丹明(及其家属)几乎是同样的兴奋,导致大量的频谱流通。

选择两个或两个以上的荧光基团的单波长激光同时激发严重限制了实验参数。 荧光光谱必须允许同时激发显着重叠,但大多数组合,一个荧光会被激发到一个更高的程度上比其他人。 此外,发射光谱应该从每个荧光团是精心选择的带通滤波器,有效地分离的信号的最小为重叠度。 此外,在最短的荧光激发波长的发射光谱不重叠的荧光团的吸收光谱来避免能量转移效应。 由于这些严格的要求,以及合适的荧光普遍缺乏,多数研究者选择两个或两个以上的激光共聚焦显微镜多标记实验。

两个宽视场和激光共聚焦显微镜使用了镀膜玻璃或多个薄膜干涉层荧光发射信号分离过滤器。 在这些仪器中,一个 双色分光镜 把光分成两个途径,一个反映到样品和其他传送到探测器。 一个带通 屏障 发射 滤波器由分束器发送提炼之前由探测器收集的光,一个电荷耦合器件( CCD )或光电倍增管。 双色镜和屏障过滤器执行的功能的限制的激发光到达检测器和从一个单一的荧光收集最多发射信号不允许从其他的荧光排放污染的信号。 因此,荧光发射的分离是高度依赖于滤波器的特性。 良好的间距和/或过宽的发射光谱谱线,可以利用宽通带发射滤波器覆盖一百纳米或更大,并产生明亮的图像,由于荧光信号通过滤波器的高水平。 这些高信号电平可以通过中性密度过滤器在广角荧光共聚焦显微镜或通过降低激光功率控制。 相反,紧密重叠发射光谱需要最佳的分离很窄的带通滤波器,但在较低的信号电平的成本。

使用滤波器组检测的荧光发射是通过过滤收集所有的光子都以同样的方式处理的主要缺点,无论源。 通过一个典型的滤波器组的传输不必要的波长一般在光子穿过总数的百分之10。 为了解决这个难题,共焦制造商正在开发 多光谱 这是能够区分基于单个荧光光谱,荧光发射源仪器(一种技术,通常称为 发射指纹 )。 这些先进的仪器的设计,这将可能成为现代共焦显微镜的中心,利用一个或更多的几种可供选择的区分排放在实验中,它是不可能的或可行的选择,非重叠的荧光探针。 在多光谱成像的最简单的方法是解剖的荧光发射波长为用细内衬色散光栅和极限集使用可移动的狭缝的特定区域。 第二种方法使用一个棱镜和声光偏转器代替色散光栅具有相同的功能,而三分之一的夫妇的色散光栅设计的多通道光电倍增管收集一系列窄波段(10纳米)。 多光谱显微结构各有其优点和局限性,但所有三个能够波长歧视的分辨率只有几纳米。

多光谱激光共聚焦显微镜的方法是选择当成像的多个荧光蛋白变体在一个单一的实验或自然发生的和固定的诱导荧光(通常统称为 自体荧光物镜 的荧光信号)的面具。 不必要的发射信号的自体荧光和其他形式往往跨越多个频道,一个复杂的定量分析的因素。 此外,当四个或更多的荧光基团被使用在一个单一的实验,光谱重叠的一个显着的程度,并导致流通通过工件,是不可避免的。 在这种情况下,多光谱成像是消除流通的最有前途的技术之一。 多光谱成像的缺点之一是减少信号伴随通常需要的荧光发射分离狭窄的检测窗口。 消除流通的新兴工具的方法(称为荧光寿命成像显微镜,或摄影 )是基于 门控 荧光寿命研究的输出相似的光谱谱线,荧光可以区分由于各自的衰减特性。

虽然多光谱成像是一种很有前途的处理光谱泄放通过新的方法,所需的仪器是目前非常昂贵。 激光共聚焦显微镜配备声光可调谐滤波器( 的案例 )或类似的快速激光线开关装置可以有效地利用顺序扫描标本,使用一种称为高速频道切换或技术 multitracking 这种方法使单个荧光基团以减少或消除流通通过发射顺序激发和收集,但并不能解决问题时,吸收和发射光谱重叠广泛。 在实践中,激光线的快速切换,无论是单独或整个框架,连接到每个通道作为其目标的荧光激发序列检测(见图4)。 例如图4所示,用Alexa Fluor 488和Cy3,488纳米的氩离子激光线采用激发Alexa Fluor 488是打开激光扫描在年线 X 方向的同时,收集的Alexa Fluor 488发射使用设置为适当的滤波器的信道检测器。 在返回路径,488纳米线的关闭和样品中的Cy3荧光探针与543纳米氦氖激光线激发,又只收集荧光发射使用的Cy3兼容滤波器组的第二信道检测器。 这避免激发荧光扫描序列都同时是一个可控制流通最有效的方法,尤其是当发射滤波器的选择是有限的。

顺序扫描帧的每个通道荧光信号的并行采集是一个产生固定的标本,固定化很好的图像很好的方法。 然而,当采集图像已被标记有两个或两个以上的荧光活细胞,甚至一个小的运动程度的亚细胞结构会妥协的图像和减少共定位精度的研究。 因此,对活细胞的调查更谨慎的使用快速多轨线扫描快速单个激光线之间的开关,每个信道在一个时间框架是被记录在案的线图像信息采集。 激光共聚焦显微镜配备了AOTF激光控制器可交替线速度媲美或超过时所获得的扫描两个或三个通道同时对旧仪器扫描图像采集。

通过荧光蛋白在流通

荧光蛋白,其发射波长从蓝色到红色现在广泛使用,是非常有效的用于活细胞成像研究使用激光共聚焦显微镜,尽管有一些权衡。 例如,数据采集的速度降低时,两种以上受雇在一个实验中,每个荧光蛋白通常需要完全不同的图像采集条件。 解决频谱流通往往是更复杂的比传统荧光蛋白合成探针,特别是因为前者的发射光谱往往是相当广泛的。 此外,由于不同的荧光蛋白的相对亮度的变化,每一种颜色都可能需要不同的信号积分时间。 增强型青色和蓝色的品种( 生物 环抱式接骨板 )很暗淡相比,绿色和黄色荧光蛋白,需要更长的采集时间,饱和明亮的荧光团。 因此,当使用荧光蛋白,实验要求必须与荧光的选择来确定,以及分离的光谱特征是相似的发射强度的组合。

一个优雅的例子,通过使用荧光共焦成像的流通与高度重叠的光谱管理是增强型绿色荧光蛋白(同时检测 EGFP )和增强型黄色荧光蛋白( EYFP )在活细胞。 在这种情况下,黄色荧光蛋白的图像的收集应首先使用的氩离子激光514纳米的光谱线,其中只有轻微的激发的绿色荧光蛋白(见图5)。 最佳的检测,光电倍增管检测器缝应该设置一个延伸的窄带宽的地区只有20纳米(530纳米到550纳米;图5(b))或类似的带通滤波器可以采用屏障。 然而,该发射滤波器带宽的精确的大小并不重要,因为只有黄色荧光蛋白是兴奋。

在第二顺序扫描,氩离子激光器的477纳米线是用于图像的绿色荧光蛋白在一个很窄的带通(10纳米490-500毫微米;图5)发射滤波器的带宽或缝。 由于发射收集此实例中的关键,它是更容易执行成像序列,利用狭缝排除EYFP流通通过信号强度的费用。 请注意,虽然488纳米氩离子激光谱线更接近的增强型绿色荧光蛋白激发最大,它太靠近发射滤波器(或狭缝)带通区域以排除激光反射光会使图像采集。

目前,最明亮的荧光蛋白绿色和黄色,但这些物种之间的歧视,往往是成功的事实,它们的光谱峰的只有25纳米分离的阻碍。 正如上面所讨论的,双重或多色实验用绿色和黄色荧光的组合是可能的,但流通之间通过滤波器组和/或从根本上减少带宽检测狭缝的必要性,提出了一个重大的问题。 更常见的是,黄色荧光蛋白耦合双色成像实验的青色荧光蛋白。 虽然青色荧光蛋白不比蓝色的物种更明亮,它已经能够与458纳米的氩离子激光线常用的共聚焦显微镜上激发的两大优势,而且更耐漂白比蓝色荧光蛋白。

组合的红色荧光蛋白绿色或黄色荧光蛋白也能产生足够的光谱分离,但生物制品,如缓慢的成熟和团聚体的形成,往往复杂的研究与红色荧光蛋白的种类。 第二代红色荧光蛋白质应解决生物问题产生的多标记实验的优秀的候选人。 新荧光蛋白质的排放概况延伸到远红光和近红外的地平线上。 这些荧光团应该能够利用红氦氖633纳米的光谱线,目前在很多高端的共焦系统。

量子点

量子点,这是涂有亲水性聚合物壳半导体纳米晶和共轭的抗体或其它生物活性基团,有没有最传统的荧光团的共享。 不同于典型的有机荧光染料或荧光蛋白,它显示了高度定义的频谱分布,量子点的吸收光谱,增加稳步减少波长。 相反,荧光发射强度限制在一个最大波长依赖于点的大小对称峰,但独立的激发波长。 作为一个结果,相同的发射中观察到无论量子点是在300,400,500或600纳米,兴奋,但荧光强度急剧增加,在较短的激发波长。 例如,一个典型的量子点的共轭,发出橙色区域的消光系数(605纳米)是约5倍时,半导体是在400和600纳米的激发。 在一个典型的量子点的共轭大约是30纳米半最大值宽度,和光谱剖面不朝较长的波长(具有较高的强度,扭曲的“尾巴”),与大多数有机荧光染料的情况就是这样。 窄的发射谱使几个量子点偶联物是一个最低水平的同时通过观察流通。

在激光共聚焦显微镜,量子点激发不同程度的效率最多的普通激光系统产生的光谱线,包括氩,氦镉,氪氩,氦氖和绿色。 特别有效的令人兴奋的量子点中的紫色和紫外区域的新的蓝光二极管和二极管泵浦固体激光器,具有突出的谱线在442纳米及以下。 405纳米的蓝色激光二极管是一种经济的激励源,使用量子点由于其高的消光系数在这个波长是非常有效的。 在激光共聚焦显微镜使用这些荧光团的另一个优点是刺激多个量子点大小的能力(和光谱的颜色)在同一试样与一个单一的激发波长,使这些探针的多标记实验的优秀的候选人。 量子点是目前的发射最大值从525到705纳米的20至40纳米的增量扩展,和一个近红外探头的发射峰在800纳米。 通过仔细选择合适的量子点的组合(例如,525,585,和655;见图6),共聚焦实验可以与一个单一的激光和显着减少流通的工件时,相比传统的荧光团进行了。

通过校正流通

由于数量的荧光信号在多标记实验可以轻易地超过了检测系统的分辨能力,无论仪器的复杂程度,收购后的图像处理是经常流通通过校正的唯一选择。 一系列的控制样品应准备在进行多个标记为两个或两个以上的荧光减少因流通通过工件实验结果的混乱。 最重要的是控制无二次抗体或合成的荧光团(的标本制备 背景控制 )和标签的标本分别(每个荧光团的 流通控制 )。 后台控制应独立地研究每个激光和检测通道的信号增益和偏移,应采用最终成像序列的极限。 所有的通道将被用于图像的多标记试样必须经过一个独立的背景校正,因为每个通道的荧光水平也有很大的差别。 一般来说,荧光比较短的激发波长,如那些所发出的紫外线,405纳米和488纳米二极管,氩离子激光器。 绿色,黄色,橙色和红色激光通道,是不容易受到荧光工件。

流通的控制是必要的确定信号增益量可能在每个通道没有引发流通到相邻信道。 例如,当检查双标记的荧光素和罗丹明标本,标本含有荧光素和罗丹明就应该准备。 建立水平控制流通,荧光成像与氩离子激光488纳米的最佳条件下,信号在罗丹明通道记录的数量(注有标本中没有罗丹明染料)。 这个信号是通过结合背景荧光眼底流通。 重复这一过程与罗丹明的控制,这一次激动人心的氦氖543纳米线和检查排到荧光通道。

这种方法通过校正需要流通的荧光强度和荧光团浓度之间的关系是不变的图像中的所有像素。 光电倍增管用于激光共聚焦显微镜表现出良好的线性成像时,在一个单一的波长,但在所观察到的信号电平的大的变化可以与单个频道由于光电倍增管的量子效率、波长的探测光之间的高度非线性关系(尤其是在响应曲线的极端)。 此外,局部环境变量和光漂白在区域研究的影响必须考虑。 在荧光发射光谱的波长分布的变化,虽然不太可能与最流行的探针,将影响获得的荧光信号的检测器之间的相对分布。

一旦有合适的控制已准备和分析,它是可能的估计信号量的流通是可能发生在试样的荧光团对目标成像。 正如上面所讨论的,甚至与滤波器带宽的优化,荧光发射的一部分将渗入罗丹明通道和一些罗丹明排放会渗入荧光素通道,虽然罗丹明流通会比观察荧光素少得多。 一些商业软件包可以处理流通通过数据使用 线性分解 算法,和共聚焦显微镜制造商经常束类似的软件和工具。 该软件可以应用线性联立方程校正算法对图像中的每个像素确定流通量的基础上通过与试样的强度比和控制记录。

光谱泄放通过工件很容易混淆的共振能量转移,共定位,和非特异性背景染色。 如果一个荧光发射光谱重叠显着的第二探针的吸收光谱,然后地区两个荧光共定位可能发生共振能量转移。流通 可以区分进行控制测量共振能量转移,如上所述,标本与个别荧光标记单。 共振能量转移(后可观察到流通通过校正)的兴奋与最低的最大吸收波长的荧光,然后检测的荧光团的发射光谱与激发探测通道的信号。 使用荧光素和罗丹明例,激动人心的荧光素与488纳米激光后,荧光的罗丹明通道监测。 任何信号记录在罗丹明通道可能是由于共振能量转移,但只有在地区的两个探针共定位。

结论

总之,最好的荧光共聚焦或广角荧光显微镜有最大吸收,密切配合激光和电弧放电谱线利用激发探针。 选择最丰富的目标最高的量子产率的荧光团将帮助平衡整体荧光发射。 此外,窄的发射光谱探针可以大大降低问题的流通,但不会完全消除。 光学滤波器组选择研究荧光发射应紧密匹配的探针光谱对带宽的大小和位置。 同时,干扰过滤器阻塞水平往往随制造商的不同而不同,应检查以确保不必要的荧光发射是由过滤器排除集用于成像。

许多新合成的荧光团表现出显着减少光漂白的敏感性,它允许较长的积分时间与CCD相机或光子采集时间降低激光功率在激光共聚焦显微镜。 这个结果在更高质量的图像和更少的细胞损伤过程中的活细胞成像实验。 新荧光蛋白质是比以前的版本更稳定,更可能不破坏细胞的代谢过程比合成的探针。 然而,应该指出的是,所有的荧光基团会影响细胞的行为在一定程度上的潜力,特别是如果探针的化学和物理特性是由环境变量的显着改变,如离子浓度,pH值,和疏水性的。

无论是荧光的物理特性,目标高度的特异性,以获得合适的信号水平和减少流通通过工件是必要的,尤其是在二级抗体的免疫制剂。 即使是少量的非特异性标记将产生一个高度的背景,既降低了试样的图像和混淆的定量解释。 许多设计突出的亚细胞结构的探针(如高尔基体和线粒体)具有特异性相对较低的水平,但仍然有用,因为已知的几何形状的这些细胞器。

作为制造商开发更先进的荧光团和更便宜的二极管激光系统的光谱线在可见光和近红外区域,选择了多标记实验的聚焦和广角荧光显微镜通过工件流通不会变得更加容易。 例如,激光共聚焦显微镜配备了一个405纳米的半导体激光,543纳米的氦氖激光,和一个650纳米的红色激光二极管可以激发发射光谱的波长的最大值在100纳米的荧光基团分离,从而最大限度地减少了潜在的流通。 此外,在远红光和红外发射光谱的荧光蛋白,将需要新激光谱线,不损害细胞的代谢过程,比目前的紫色,蓝色,绿色系统。