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奥林巴斯显微镜声光可调谐滤波器(AOTFs)

2014-08-21  发布者:admin 

  光电技术在激光共聚焦显微镜的整合提供了一个显着增强的光谱控制适用于各种各样的荧光研究。 声光可调谐滤波器( OTF)是一种光学装置的功能作为一个电子可调谐激发滤光片同时调节强度和从一个或多个源的多波长激光线。 这种类型的设备,依靠专业的双折射晶体的光学特性的变化的相互作用时的声波。 在声波频率的变化改变了晶体的衍射特性,能够非常快速的波长调谐,只有声运输时间在水晶有限公司。

声光可调谐滤波器设计的显微镜通常由一个二氧化碲或石英晶体的压电换能器结合。 响应于振荡射频应用( 射频 )电气信号,变频器产生的高频振动(声波)波传播到的晶体。 交变超声声波引起的折射率的周期性分布通过晶体作为透射衍射光栅或布拉格diffracter偏离入射光的一部分转化为一阶光束,它是利用显微镜(或二阶梁当入射光非偏振光;见图1)。 改变施加到晶体传感器信号的频率改变折射率的变化,周期,因此,光的波长,衍射。 衍射光束的相对强度的振幅决定(功率)应用于晶体的信号。

在传统的荧光显微镜的配置,包括许多共焦系统,光谱的激发和发射光的滤波是通过利用薄膜干涉滤光片。 这些过滤器是在几个方面的限制。 因为每个过滤器具有固定的中心波长和通带,几个过滤器必须被用来提供多光谱成像单色照明,以及衰减的强度控制的光束,和过滤器通常是由一个旋转炮塔机械互换机制。 干涉滤光片炮塔和车轮的有限波长的选择,振动速度较慢的缺点,开关,和潜在的形象转换。 他们也很容易损坏的热暴露,引起湿度,和强烈的照明,其光谱特性随时间变化。 此外,过滤器轮利用照明波长的选择变得日益复杂和昂贵的激光被雇用人数与当前的应用增加了。

旋转的滤光轮和光学块炮塔介绍机械振动转换成的成像和照明系统,因此需要大概50毫秒的阻尼时间延迟,即使滤波器过渡本身可以更迅速。 典型的过滤器更换时间大大慢于实践,然而,范围在0.1到0.5秒。 在旋转机构的机械不精确配准误差时,可以引入顺序获取的彩色图像进行处理。 此外,固定的频谱特性的干扰过滤器不允许不同的荧光团的组合优化,也不适应新的荧光染料,限制的激发和检测的显微镜功能的通用性。 的声光可调谐滤波器,共焦系统介绍克服的滤光轮缺点使快速电子调谐和从几个激光器多条激光线的强度控制。

AOTF操作的基本原理

声光晶体被定义为是声波的存在改变的光学特性。 当声波传播通过这样的材料,晶格结构交替压缩和响应于振荡波前放松。 负责本声光互作用的基本机制是众所周知的 光弹 功效 在整个晶体的晶格压缩和稀疏的区域,表现为周期性的折射率的波动可以产生入射光的衍射。 虽然声光可调谐滤波器的功能类似于一个衍射光栅,它的行为是不同的,发生在一个扩展的衍射晶体的体积而不是在一个平面上,只有有限的频带的光谱频率的影响。 在这方面,AOTF执行更多的作为一个带通滤波器比衍射光栅。 传播的声波产生的整个晶体的折射率的周期性调制,有效地产生一个移动的相位光栅,将部分的入射光,满足适当的相位匹配衍射(或动量匹配)条件。 对于一个特定的声波频率,只有一个有限的范围内(带)的光谱频率满足相位匹配条件,并成为衍射。 不同的射频驱动压电换能器的变化的光谱通带的中心,所需保持的相位匹配条件。 选择适当的驱动频率可以被调谐到不同的晶体衍射的特定波长带,然后退出晶体在相对一个独特的角度对衍射光束。

衍射波长(S)作为一种应用于晶体无线电频率信号的功能变化。 对于一组特定的AOTF设计参数(包括晶体材料和几何),中心波长( λ )的通带是由相位匹配确定(和动量匹配条件由以下方程定义):

λcenter = V • Δn/f

在前面的方程, V 是声波速度, Δn 具有声光晶体的双折射,和 F 是声波频率。 光波衍射光束传输的振幅是应用于晶体的射频功率成比例的。 因此,不同的RF信号的频率和功率提供了一种机制,用于选择光的AOTF滤波波长和强度。

在配置中的相互作用的声学和光学波的初始AOTF设计中心 共线 ,如图2所示。 在本设计中,声波发射沿晶体的主轴线,与入射光束通过偏振器和沿晶轴相同的传播路径,与声波共线相互作用(图2)。 光谱波长的窄带光为偏振方向的入射光束正交的,并且可以通过输出偏振器从耦合共线光束分离( 分析仪分光器 图2)。 如前所述,通带的中心波长的相位匹配条件,存在光和射频信号频率之间的确定。

的共线AOTF几何限制使用一个类的有限的晶体,而不幸的是,不包括一些最有效的声光材料。 为了充分利用的好处,如二氧化碲材料,并利用几何是简单的制造,配置中的声学和光学波 非共线 开发(图1)。 在本设计中,窄带和宽带光的衍射光入射是分开的,因为他们退出晶体偏振器通过不同的途径,不需要操作。 零级衍射光束可以由一个光束阻挡阻挡,而过滤的衍射光束被用于标本照明。 这种现象称为 声走 如图1所示的声群速度和声学波法线之间的角度差,方差,是许多声光器件常见。 在一个共线AOTF配置的意义(图2),虽然光线的传播方向与声波的相速度是由定义的共线,由此产生的声波的群速度如下一个稍微不同的角度。

当非偏振光入射光束在非共线配置(描述为一个集中的光锥,图1),光束的衍射部分包括两个空间分离的一阶光束,正交极化的。 如果输入光束的AOTF为线偏振光(如用激光源),只有一个衍射光束退出装置,其偏振状态旋转90度相对于输入偏振轴。 因为两个正交极化阶梁不分开,直到他们离开的晶体,然后在一个固定的角发散,衍射角(和由此产生的图像的空间位置)不随波长。 在应用中,利用非共线AOTF作为可调谐滤波器,一级衍射分量允许照射样品(通常只有一个衍射输出被使用),而零阶光束受阻。 两个光束是由几度分开,这是一个功能的装置的设计。 利用晶体具有较大的双折射值,这 偏转角度 (角分离的衍射和衍射光束)的增加,实现之间的衍射和衍射光束的偏振片充分的分离不使用一个理想的属性。 由衍射光束被偏转角度至少为二氧化碲晶体系统时,光束入射角是平行的 110。 轴(在90度到光轴),并增加了8和9度的相对于[ 110 ]轴入射角的增加之间的实际的限制。 偏转角度之间发生的衍射和衍射光束后留下的晶体具有以下关系对晶体材料的双折射:

θi - θd = Δn sin 2θi

在上面的表达式中,θ(i)和θ(d)是角度,相对于所述光学轴,入射和衍射光束,分别的。双折射是由的Δn表示。基于操作的共线模式AOTF设备,如那些使用石英作为双折射材料,可以被认为是共线设计的简化的变异与入射角,θ(i)中,90度,和一个零偏转角。

虽然原则上,各向同性和各向异性的布拉格衍射图案可以利用的光谱过滤机制,一个关键的限制存在于各向同性过滤介质的使用,因为光谱通带的光入射孔径角的变化,因此良好的准直光束是必不可少的。 角孔径对通带特性的事实,在入射角的变化产生的动量不匹配结果的影响,导致衍射光束被偏转不同波长。 一个发散光束,光学通带宽度对准直光束,急剧增加,严重限制了该滤波器的实际孔径角。

各向异性的声光滤波器具有一个很窄的通带可以在一个大范围的入射光束的角度保持实际优势。 有了这个设计,衍射光束的偏振面旋转90度的相对衍射光束的偏振方向。 因为一般在双折射晶体的光折射率的不平等和非凡的经历,声波传播方向可选择的事件引起的群速度和衍射光是共线(下简称 非临界相位匹配 )。 在这种情况下,由入射光束的角动量失配的变化产生的最大双折射角变化引起的偏移量。 由于非临界相位匹配条件被满足在一个大范围的入射光束的角度,对非共线AOTF的视场角是比较高的,同时保持理想的特性,如窄通带。

对AOTF的制作材料

在近年来的应用利用声光器件的数量显着增加,主要是由于其制造材料的改进的发生发展。 一个适当的材料的选择取决于特定设备的目标函数。 例如,磷化镓具有宽带声光偏转器和调制器的建设的优良特性,但由于其晶体结构是光学各向同性的,材料是不适合的可调谐滤波器装置。 具体的一般要求,然而,适用于任何类型的光学装置,其中包括高透光率在波长范围加以利用,在足够大的单晶体的可用性,合理的费用,除其他因素。 评估材料的性能是一个因素,称为声光的一个有用的变量 图的优点 适当的定义,为特定的设备类型。 文献提出了至少五种不同的表达式计算图的优点,采用变量视为特定的设备功能相关。 参数通常被认为是包括的折射率,密度指数,声波速度,带宽,分辨率(通过各种方法定义的),以及一系列的弹光系数。 必须在AOTF设计优化的具体变量衍射效率,波长分辨率,和立体角孔径。 无论该方程用于计算,任何数字的优点是一般表示为无量纲值归一化到适当确定的绝对值为石英。

非共线和共线AOTFs主要规格
规格 非共线
(二氧化碲
)
共线 
(石英)
Wavelength Tuning Range 0.38 - 5.5 µm 0.2 - 1.0 µm
Acoustic Tuning Range
(Single Transducer)
1 octave 1 octave
Optical Aperture 0.1 - 1.5 cm2 0.1 - 5.0 cm2
Solid Angular Aperture 5 - 15 degrees 2 - 5 degrees
Deflection Angle (θi - θd) 3 - 9 degrees 0 degrees
Diffraction Efficiency
(Polarized Light Input)
10 - 90 percent 20 - 90 percent
Tuning Speed 4 - 20 µsec 14 - 35 µsec
Extinction Ratio greater than 1000 greater than 1000
Input RF Power 0.5 - 3 watts 5 - 30 watts
Input RF Frequency 20 - 200 MHz 50 - 220 MHz
Piezoelectric Transducer
Material
LiNbO3 LiNbO3

表1

基于它的许多良好的性质,以及由此产生的高氧化碲声光图的优点,是目前首选的AOTF的材料。 首次报道在非共线AOTF操作模式试验示范使用在可见光谱区中碲晶体进行操作。 所描述的装置是可调谐输出波长范围700至450纳米(通带中心)从100至180兆赫的射频驱动频率的变化。 过滤后的光束相对于入射光束的衍射角为6度,近百分之100的入射光被衍射在120毫瓦的功率驱动。

二氧化碲是官能在整个可见光谱并进入红外高达约5.5微米的波长,并且具有短的波长传输截止在约350纳米。为了给AOTF可使用的范围延伸到远紫外线或进一步到红外线,另一种材料必须采用。的二氧化碲设备的初始发展后,晶状石英被用来扩大工作范围到紫外线,并进一步延伸到红外区域已经完成与铊 - 砷 - 硒结晶。扩大的光谱范围可达到与AOTFs主要是由执行有效的材料的可用性和在所期望的波长波段的高透明性的限制。

如前面所讨论的,因为适合于共线AOTF的操作模式晶体类的有限数目的,显著更多的努力已集中于开发材料的非共线的设备。性能规范文献中报道的用于非共线AOTFs采用各种材料,包括二氧化碲,铊,砷,硒,和氯化汞在红外线操作(高达约11微米的波长)。 AOTFs用于调谐在紫外光谱区已制作由结晶石英,氟化镁,和蓝宝石(氧化铝)。水晶是用于操作在紫外区的优选材料。因为优点为石英的声光数字仅为约0.002的二氧化碲,石英系AOTFs具有较低的衍射效率进行,并且需要较高的或许10倍的功率值来驱动射频换能器,在比较二氧化碲滤波器。

AOTF的功能特点

最常用的AOTF设计用于在成像系统中的频谱控制是基于在非共线方式操作二氧化碲,并且它因此考虑该设备的某些操作特性,这涉及到它的典型应用是有用的。 AOTF的波长调谐特性是最重要的,最常见的这些应用。动量(和相位)匹配条件规定,选择用于衍射的波长是由施加到声换能器和所得到的声波频率的驱动频率来确定。图3示出一个典型的调谐曲线为二氧化碲的非共线的AOTF在可见光到近红外光谱范围内。选定的波长和施加RF频率之间的调谐关系对两个正交极化的输出光束一般是不同的,并且每个的特征在于,一个单独的数学表达式。随声波频率的透射中心波长减小。的频率和调谐波长变化的近似逆的方式,虽然这是不准确的,由于这一事实,即折射率为正常和非常光线的比例也随波长而变化。这两个输出光之间的波长差,从几纳米变化到几十纳米,这取决于设备的配置。相关设计参数确定的AOTF晶体调谐关系是声波传播中,相对于[110]轴与入射光的输入相对于所述光轴的,典型地被指定为α,θ(i)的角度,分别为。对这些设备的角度的一些组合中,如果入射光被偏振,只有一个偏振分量满足非临界相位匹配条件,而其他表现出与入射光束的角度调谐的关系的变化。

声光可调谐滤波器是由压电换能器,它通常是一个八度或更低的电 - 声带宽在其波长调谐范围的限制。这个值是显著小于调谐晶体的光传输范围,并且一些可商购的AOTFs设置有多个换能器,被设计为不同的带宽,增加的可调波长范围内。 AOTF的极其快速的调谐速度是其主要优点为在显微镜的照明控制之一,并且该属性仅由弹性波的渡越时间的晶体(相当于中转距离由声速除以)中限定。在非共线装置中,声波传播距离是名义上等于所述光学孔径。虽然较高的声速对应更大的调谐速度,一些材料的衍射效率,包括二氧化碲,变化为音速的立方成反比。因此,较低的声波速度规范可有利地用于器件如AOTFs。为二氧化碲,纵波沿<001>方向上传播的具有每秒超过400公里的速度,而与此相反,传播平行于<110>剪力波以每秒约617米异常低的速度行驶。这种AOTF在此“慢剪切模式”操作提供了改进的衍射效率,同时还显示出小于10微秒调谐的响应时间。调谐速度为这种设计范围从几微秒至几十取决于孔径大小(声波传播的距离)和其它的配置属性,微秒的典型AOTFs如换能器和其上的晶体放置的特性。

AOTF的波长切换功能可以被用来提供一种快速可调光源,其可以在多种模式下,都适用于光学显微镜下操作。单一照明波长可以按顺序被调谐或随机访问,并且能够同时从所述滤波器输出的多个波长。不同于传统的衍射光栅或棱镜,交换可以马上随机指定波长之间进行不扫描通过中间波长。每个调谐的波长通过电子方式切换到对应的RF驱动频率定向到该装置的输出。如果一个以上的射频驱动频率被施加到压电换能器,该传播可变声波能够同时衍射多种光波长。无线电频率驱动换能器的数目和相对功率可以迅速变化,以控制所发射的光的强度和波长。可同时使用的频率的数量是由压电换能器的功率处理能力来确定,并且通过满足必要为每个衍射波长的最小功率时的总驱动力的无线电频率被应用之间进行分配的要求。基于非共线二氧化碲配置市售AOTFs,在可见光和近红外光谱范围内工作,通常限制在10至12个同时的输出通道。以继续在低功耗AOTFs的发展技术的进步,可以预测,超过100个可控制的通道将能够与即将到来的设备。

一个可调谐滤光器的光谱分辨率的定义是在一半最大值处从所选择的光输出的主瓣的整个宽度,并且是两个波长和设备的配置的功能。一个典型的AOTF的范围从几纳米的分辨率(带通)到几十纳米的可见光和近红外光谱区,约三十分之一的普通布喇格衍射的值。影响分辨率的设计参数包括结晶材料的分散常数(与双折射的程度),则入射角,并且声光相互作用长度。

根据目前的理论理事AOTFs的调谐特性,具有波长正好满足相位匹配条件仅光源的衍射光束(S)中被发送,对于具有无限大的声光相互作用长度的装置。然而在实践中,有限的相互作用长度的结果,在滤波器的通带,它定义了设备的光谱分辨率的扩大。相反,衍射光栅,在一半最大值处的AOTF的透射峰的变化,因为波长的平方的函数的整个宽度,从而产生可变的带通。扫描时,在整个波长调谐范围,典型的AOTF可见光谱区域内运行呈现出带通规范的变化大约2〜6纳米。

在非共线的AOTF设计的,如前面所讨论的,所施加的RF频率和衍射的波长之间的调谐关系对两个正交极化的一阶光束不同。因此,他们的波长是不同的,只有一个符合非临界相位匹配条件,这是可取的,以便最大限度地考虑到设备的视场角。在一些需要从AOTF增加输出强度的应用中,有利的是利用结合衍射输出。虽然有可能用标准的AOTF选择输入入射角相对于固定的晶轴与声传播方向而导致在这两个偏振光束的等效调谐关系的,这种策略减少了光谱分辨率。特殊用途的二氧化非共线AOTFs碲也已制成具有专门选择,以产生具有相同的调谐关系衍射输出的设计参数,并与两个满足在近红外光谱区的非临界相位匹配条件。

作为施加于激光扫描共聚焦显微镜中,AOTF的最显著优点之一是它的能力来代替更为复杂和笨重的过滤机制,用于控制光的传输,并施加强度调制的波长鉴别的目的。执行中的衍射光束的强度和波长极其快速调整的能力使AOTF独特的控制能力。通过改变在不同波长的照射强度,多个荧光团的反应,例如,可以实现最佳的检测和记录均衡。另外,随着相位和频率锁定技术的数字信号处理器可以被用来从多个荧光团区分发射或从背景中提取的低电平信号。

利用一个声光可调谐滤波器,用于共焦显微镜的实用光源配置方案被示于图4中三个激光系统(氦 - 镉,氩气和氩氪气)的输出被二色反射镜通过AOTF合并​​,并指示其中所述第一级衍射束(绿色)是共线的,并且发射到单模光纤。的非衍射的激光束(绿色,黄色和红色)退出的AOTF以不同的角度和由波束停止吸收(未示出)。由每个激光产生的主要线(波长)来表示(单位为纳米)下的热和冷镜。二色镜反射的波长比525纳米的低,发射波长更长。通过氩 - 氪激光器(568)和(648纳米)的产生两个较长波长的线由热反射镜反射,而氩激光(458,476,488,和514纳米)的输出被二色反射镜反射,并结合与来自氩 - 氪激光器所发射的光。从氦 - 镉激光(442纳米)的输出由冷镜反射的和结合的较长的波长从其他两个激光器,它通过反射镜发射。

因为从AOTF晶体的声学换能器的快速光响应的,声光相互作用是受突然的转变类似于一个矩形,而不是正弦波形。这导致在旁瓣中的中央透射峰的任一侧上的声光可调滤波器的通带的发生。在理想的声 - 光条件下,这些旁瓣应当是对称的左右中央峰,与具有中央峰的强度为4.7%的第一叶。在实践中,旁瓣通常是不对称的,并表现出从预测的结构等的偏差,在声光相互作用引起的变化,以及其他因素。为了减少在通带内,以不显着水平的副瓣,多种类型的弹性波的振幅变迹都采用,包括各种窗函数,已发现30到40分贝抑制的最高旁瓣。可在减少与非共线AOTFs旁瓣电平的可使用的一种方法是通过对换能器的加权激励的手段来应用空间变迹。在共线声光滤波器,采用不同的方法已经被使用,它引入了一个声脉冲,变迹的时候,进入过滤结晶。

一个AOTF的有效线性孔径由一维声束的高度和由在其他维度横跨光学孔径的声衰减(在声波传播的距离)的限制。在AOTF晶体内所产生的声束的高度由性能和声学换能器的物理特性决定的。在晶体材料如二氧化碲声衰减正比于声频率的平方,并且因此是一个比较麻烦的限制线性孔径大小在更短的波长的可见光范围内,这就需要更高的RF频率进行调谐。近红外和红外辐射产生的,因为与这些较长波长的衍射相关联的较低的声频率的限制较少的限制。 

单个声换能器的最大尺寸是由性能和功率要求除了仪器配置的几何限制的约束,并AOTF设计人员可使用换能器结合到晶体的阵列,以增加传播的有效横向尺寸声束,并以放大的声光相互作用的区域。所需要的驱动功率是在声光设计中最重要的变量之一,并且通常与光学孔径和更长的波长而增加。相反,声衰减,这是减少在红外光谱范围内,以驱动换能器的红外线AOTFs需要更高的功率是在这些设备的最大限制之一。高的驱动功率电平导致的晶体,这可能会导致热漂移和不稳定的滤波器性能的加热。这是特别的一个问题时,声功率和频率而变化迅速,大范围的,和晶体温度没有足够的时间来稳定,产生的折射率瞬态变化。如果应用程序需要的波长和强度的稳定性和可重复性,在AOTF中应保持在一个恒定的温度。采取由设备制造商,以尽量减少此问题的一种方法是将加热超过环境温度的晶体,到一定程度,它是相对地不受由换能器的驱动功率的附加的热输入。另一种解决方案是,房子在一个热电的AOTF冷却外壳,可提供精确的温度调节。持续发展努力承诺导致新的材料,可以提供相对较大的孔相结合的过滤和未过滤束的有效分离,不使用偏振器,而需要的典型装置的驱动功率的一小部分。

在非共线的AOTF,其在空间上分离的入射光和衍射光的路径时,偏转角(对角分离衍射和非衍射光束离开晶体)是一个额外的因素限制了装置的有效孔径。如先前所讨论的,偏转角为大于对于具有更大的双折射晶体,并且确定部分所需的衍射和非衍射光束的足够的分离的传播距离离开晶体后发生。所需的距离增大为较大的入口孔,和该规定,因为对组件的物理尺寸可以被并入到显微镜系统约束对最大孔径大小有实际限制。的孔径角是关系到AOTF中,在成像系统中的一个重要因素的总集光功率,虽然为了实现全孔径角而不在非共线的AOTF使用偏光板,其值必须是比偏转角小。 

因为声光可调谐滤波器是不显微镜系统的图象形成部件(因为它通常被用于源过滤),有评价的空间分辨率为这种类型的设备的任何特定方法。但是,声光可调滤波器可以限制由于其有限的线性孔径大小和接受角的成像系统的可达到的空间分辨率,以相同的方式与其他的光学部件。根据瑞利准则和AOTF的角位移和线孔,可分辨的图像元素的最大数量可以被计算为一个给定的波长,使用了极性和方位角的平面不同的表达式。尽管衍射极限的分辨率可以得到在方位角平面上,分散在AOTF限制在极性面的分辨率,并且必须采取措施来抑制这种因子,以获得最佳的性能。上波长的偏转角的依赖性可以产生一种形式的分散体中,当在一个相对窄的带宽进行调整,但在涉及操作在宽的光谱范围内的应用程序显著通常是可以忽略的。变化与波长的偏转角可以在调节过程中产生的图像的变化,在诸如激发的不同波长的荧光的比值的成像技术产生的错误,并且在其他多光谱的应用程序。时的图像偏移服从一个已知的关系,以波长,校正可通过数字处理技术被应用。分散体的其他作用,包括降低的角分辨率,可能会导致图像质量下降,如模糊,这需要更复杂的措施来抑制。

在共聚焦显微镜AOTF优势总结

综合考虑,涉及到AOTFs在成像系统中的应用程序的操作和性能因素的基本原则,许多这类设备的光控荧光共聚焦显微镜的优点是显而易见的。 AOTF中的几个好处结合起来,极大地提高了最新一代的激光共聚焦仪器的多功能性,而这些设备正在成为流行的激发波长范围和强度的控制越来越多。促进所述的AOTF的几乎每一个优点主要特性是它的能力,以允许在逐个象素的基础上的强度和/或照明波长的显微镜控制,同时保持高的扫描速率。这个单一特征转化成各种各样的有用的分析显微镜工具,其进一步在灵活性增强当激光照射时使用。 

其中最有用的AOTF功能允许的小用户定义的试样的区域(感兴趣的通常被称为区域; ROI)的选择,可与任一较大或较小强度被照亮,并在不同的波长,用于精确控制在漂白工艺,激发率研究,共振能量转移的调查,或光谱测量(参见图5)。照明强度,不仅可以在选定的区域可以增加控制的光漂白实验,但可以衰减在所希望的区域,以减少不必要的光漂白。当该照明区域是根据AOTF控制,激光曝光被限制为默认的扫描区域,以及该装置的非常快速的响应可以被用来检流计扫描镜周期的回扫间隔期间提供光束消隐,从而进一步限制了不必要的标本暴露。在实践中,激发地区按徒手画或使用工具制作所定义的几何形状,在电脑显示器上的图像覆盖面通常定义。一些系统允许激光照射来定义任意数目的样本区,激光强度被设置为不同的电平的每个区域中,在强度增量小到了0.1%。当AOTF是结合多个激光器和软件,允许连续观测的时间过程控制,时间推移实验可设计成获得在单次实验中,这可能,例如,被定义为对应于不同的从几个不同的区域的数据细胞器。 

图5示出了兴趣(投资回报),在激光扫描共聚焦显微镜先进的荧光应用中创建用户定义的区域的几个例子。在每个图像中,投资回报率都列出了一个黄色的边框。在图5中给出的鼠袋鼠细胞(PTK2线)(a)的矩形区域中已被指定为光漂白实验细胞质的中央部。驻留在这个区域的荧光团可通过高功率激光强度被选择性破坏,荧光的后续恢复监视测定扩散系数。几个徒手的ROI被显示在图5(b)所示,其可以是目标对选定的照度或光漂白实验。 (;麂细胞与黄色荧光蛋白图5(c))在共振能量转移(FRET),荧光发射率可以通过在共聚焦显微镜的选定区域通过观察漂白在这些方面的受体荧光的效果容易地确定。激光激发的在选定区域具有共焦显微镜的AOTF控制也是蛋白质扩散的使用荧光蛋白在光活化的研究调查是有用的,如图5(d)所示。此图像帧呈现在枫蛋白的荧光发射峰,因为它从绿色转变为红色的HeLa使用所选照明(黄色方块)与405纳米的蓝紫色激光二极管(人宫颈癌)细胞。

AOTF的快速强度和波长切换功能可在每个激发波长可以以平衡各信号电平,以获得最佳的成像被分配一个不同强度的多个激光线将被执行的顺序线扫描。从各荧光团同时减少交叉,可以是具有同步多波长励磁用显著问题个别的行顺序扫描减少信号采集之间的时间差(参见图6)。多个荧光探针的同步掺入活细胞已经发展成为一个非常有价值的技术的蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究中,与高分子复合组件的动态特性。的技术将绿色荧光蛋白(GFP)及其众多衍生物进入细胞的蛋白合成机制的细化已经彻底改变了活细胞的实验。用活组织多个探头研究的一个主要挑战是必须要获得完整的多光谱数据集的速度不够快,以减少样本的运动和分子的变化,可能扭曲真实的试样几何形状或事件的动态序列。在AOTF中提供的速度和多功能性,以控制波长和强度照射多个样品的区域,并同时或依次扫描各以足够的速度准确地监测动态细胞过程。 

AOTFs和中性密度滤镜的应用程序来控制激光共聚焦显微镜的荧光光谱分离的比较示于图6。标本是贴壁赤麂鹿沾上的Alexa Fluor皮肤成纤维细胞568结合到鬼笔环肽单层培养(目标丝状肌动蛋白网络)和SYTOX绿色(染色在细胞核中的DNA)。产生的高激励信号所必需的两种荧光团中性密度滤光片导致显著量泄流通过SYTOX绿发射的进入的Alexa Fluor568信道(图6的(a),记下黄核)。 SYTOX绿和Alexa Fluor568之间的共定位的高度在图6中清楚地示出的散点图(b)所示。在散点图两轴代表SYTOX绿色(横坐标)和的Alexa Fluor568(纵坐标)的渠道。为了平衡所必需的激发功率水平来选择性地照射每个荧光团具有更大的控制发光强度的,一个AOTF被用于选择性降低SYTOX绿激发功率(氩离子激光线在488纳米)。注意,在随后的减少渗出,通过如在图6(c)该细胞的细胞核表现为绿色。相应的散点图(图6(D))表示渗出通过SYTOX绿色的显着水平降低到的Alexa Fluor568路。 

AOTF的发展光漂白(FRAP),荧光损失在光漂白(FLIP),以及在局部光活化荧光(解笼锁)的研究(参见图5)后,提供了大量的附加的通用性,如荧光恢复技术。该FRAP技术的初衷是测量荧光标记蛋白质的细胞器和细胞膜扩散速率。在以往的FRAP过程,在试样上的一小点被连续地照射在低光束的水平和所发射的荧光进行测定。的照度水平,然后上升到非常高的水平很短的时间通过快速漂白破坏在被照射的区域中的荧光分子。后的光强度,返回到原来的低电平时,荧光被监测,以确定在哪些新的漂白的荧光分子扩散到耗尽区的速率。的技术中,作为一般使用,已经由漂白的区域,这往往是受衍射限制光斑的固定几何形状的限制,并且由具有以机械方式调节的照明强度(使用挡板或检流计驱动的组件)。在AOTF中,不仅允许的光强度接近瞬时切换,但也可以用于选择性地漂白的不规则形状,线,或特定的细胞器,随机指定的区域,并确定分子转移到该区域的动态。 

通过使照明光束的几何形状和波长和强度的快速切换的精确控制,在AOTF是显著增强应用的倒装技术在测定某些细胞蛋白质的扩散迁移率。这种技术监测的荧光从连续点亮局部区域的损失和荧光团从遥远的地方到枯竭的网站再分配。获得的数据可在细胞内和细胞间部件之间的动态相互关系的确定有助于活组织,并且这种荧光损失研究是由AOTF的控制的显微镜照明的能力极大地方便了。 

利用光活化的荧光的方法已在研究中非常有用,例如那些研究中的细胞过程的钙离子浓度的作用,但在它的灵敏度一直局限于在小细胞器或靠近细胞膜局部区域的效果。通常,通过被结合到光敏物质失活的荧光物质(称为被笼)是由从隔离罩化合物释放它们,并允许他们通过荧光突然出现的被跟踪强光照射激活。利用声光可调滤波器的推动了这种研究,以评估高度本地化的过程,如钙离子动员膜附近,因为做照明触发感兴趣的荧光分子的活化(解笼锁)的精确快速控制可能的改进。 

由于AOTF中的功能,在不使用移动的机械部件的,以电子方式控制的波长和多个激光器的强度,大的通用性被设置为外部控制和带的显微镜实验等方面的激光照射的同步。当共聚焦仪器配有一个控制器模块具有输入和输出触发端子,激光强度水平可以连续地监测和记录,并且所有的激光功能的操作可以被控制与其他试验样品的测量,自动化显微镜载物台的运动,以协调,连续的慢速录制,以及任何数量的其他操作。



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