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奥林巴斯显微镜的钙离子探针

2014-07-31  发布者:admin 

 Cameleons 是一类新的活细胞,结果在荧光共振能量转移 (烦恼) 在钙离子存在下的构象变化通过运作中的钙离子浓度的指标。在过去,荧光探针 Fura 2、 印-1 和荧光 3 等都非常受欢迎的测量活细胞内钙离子浓度的波动。1997 年,博士淳胁 (瓦科、 日本理研脑科学研究所) 的开发一种新型钙离子测量探针。这种探头由人工种蛋白质组成从绿色荧光蛋白 (GFP),修改,和一名叫Cameleon (变色龙爬虫类,但从名称中删除"h")。Cameleon 分子结构被建模为一种融合产品 (具有不同的激发和发射特性) 的两种荧光蛋白质、 钙调蛋白 (CaM) 和钙调素结合域的肌球蛋白轻链激酶 (M13) 之间。钙调素是绑定与游离钙离子的能力,它已绑定的钙离子后,M13 链可以绑定与钙调素。这些四种蛋白的基因都线性,加入并融合基因表达的各种各样的细胞。

Cameleon 嵌合体为是卓越在基因工程和苦恼,生物物理技术测量两个间隔紧密的分子之间的距离中的实际应用。一对为 FRET荧光蛋白被选择他们的特征吸收和发射谱。一个荧光基团 (捐助者) 的激发能量转移到另一个 (受体) 的磁偶极相互作用,没有捐助荧光发射。捐助者排放和受体吸收谱必须为 FRET 发生重叠。此外,能量转移发生只有当两个荧光分子内的每个其他几个纳米。对荧光蛋白,特别是一青色和黄色或蓝色和绿色的 (CFP/YFP 和 BFP/GFP) 对一般选择为 FRET 实验由于其光谱特性。

Cameleon 分子由四个域 (见图 1)。荧光蛋白加入在彼此在钙离子,没有这两个端站,但在钙离子存在下凸轮激活链接器环绕的 M13 蛋白质。Cameleon 嵌合体的三级结构然后改变,使两个荧光蛋白化合物与能量传递的范围。在低钙浓度环境中,cameleon 分子是展开和 CFP 荧光时发生分子兴奋与 442 纳米的光。然而,当钙离子浓度增加时,CFP 荧光减少和 YFP 荧光增加由于共振能量转移。

绑定的钙的钙调素基团的 cameleon 生产在整个分子,空间接近的位置的两个荧光蛋白的构象变化。这种构象,偶极能量转移由兴奋的 CFP 蛋白刺激 YFP 产生次生荧光在 530 纳米。Cameleon 设计代表第一次的基因编码的钙传感器,并提供机会,在一种相对的非侵入性的方式监测细胞的结构和生理动力学。细胞内钙离子浓度可以通过荧光比例成像中的两种类型的 cameleon 分子胞内钙离子浓度变化的比率确定。当 cameleon 分子已被兴奋在 442 的纳米 (使用从氦镉激光线) 时,可以在使用激光共聚焦扫描显微镜的 485 和 530 纳米同时检测其荧光。

在图 2 中,提出了一种由 cameleon 监测实验一典型的钙离子。在这个实验中,cameleon 嵌合体是类似于上文所述的 CFP/YFP 变体。这两个基因都在 HeLa 细胞转染脂技术同时表达。在图 2 (a),说明钙水平没有兴奋剂或镇静剂的存在。由 0.1 毫组胺刺激产生急剧增加钙离子浓度的 (图 2(b))),同时增加了 0.1 毫赛庚啶引出的拮抗作用 (结果中的钙水平降低的图 2(c))。



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