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尼康显微镜的荧光激发块

2014-07-13  发布者:admin 

 在这里我们展示如何激发块选择的平场免疫荧光显微镜可以扩展他们的能力。

平场免疫荧光显微镜是什么

荧光团

荧光现象发生时由一种物质,当它释放能量,当它从兴奋状态返回到其基态时就会发出亮光吸收特定波长的光 (励磁光)。许多荧光物质 (称为荧光团) 已经有不同的用途,与激发波长从紫外到红外。然而,发射波长通常比的长的激发能量,使得它们的波长。

平场免疫荧光显微镜

平场免疫荧光显微术指的是旨在观察上述荧光团的显微镜。光学系统包含一个光源为励磁 (通常汞灯) 和一个激发块来分开荧光激发光。有许多激发块供不同种类的荧光团,可能会切换为连续查看标本沾有多种类型的荧光团的任何时间。

平场免疫荧光显微镜中的激发块中的作用

Figure 1

如图 1 所示,2 种类型的激发快和 1 二色镜的构建激发块。选择适当的激发块和每次使用镜子使得研究人员能够达到一个高的信号信噪比 (S/N) 比之间的荧光和背景光。下文介绍了这些光学元件的功能。

励磁激发块 (EX)

Figure 2

励磁激发块是将只有激发光所需的波长从激发光源 (通常汞灯) 传递到荧光基团的光元素。如图 2 所示,只有激发波长通过激发块,通常"带通激发块"。

二色镜 (DM)

Figure 3

二色镜是分开的荧光激发光光学元件。二色镜是光的特殊的镜子,反映只有一个特定波长,允许所有其他波长的光线通过 (图 3)。在平场免疫荧光显微镜激发块中使用的分色镜放置在 45 ° 入射角,轻,创建一个"停止带"的"及格乐队"的传输的光和反射的光。光通过励磁激发块被反映 90 ° 朝着这一目标和标本。最后,从试样所产生的光是通过传递和朝向观察者 (或高灵敏度相机)。

屏障激发块 (BA) 或排放 (EM) 的激发块

Figure 4

障碍激发块分离产生的从其他背景光荧光的荧光的光学元件。如图 4 所示,屏障激发块传输阻塞所有其他轻微泄漏从 (反映从标本或光学元件) 的激励灯同时穿过二色镜荧光波长的光。这是必要的因为荧光光的强度是比超过 100,光靠一个因素的激励弱 000:1。大多数障碍激发块被放置在一个小的角度,以允许更好的荧光成像通过抑制鬼魂形象。

尼康的噪音终结者

Figure 5

尼康的平场免疫荧光显微镜都有一种专有的称为"噪音终结者"的尼康光学元件 (模型 TE2000 及更高版本)。如图 1 所示,噪音终结者允许高效加工的光通过二色镜传输通过防止光线从激发块内散射和漏入的观测图像激发。这有助于消除背景光噪声和更有效的荧光图像。

选择荧光激发块和镜

选择荧光激发块和镜子时,应遵循以下步骤。

(荧光物质) 荧光波长

确定在使用荧光的波长。此信息指出在目录里,但荧光的波长特性也略有改变不同盐度、 ph 值和胞内条件等的可解条件。因此,我们建议用荧光计测量励磁和荧光波长。然后,使用此信息来选择最适当的光学元件。

二色镜的选择

Figure 6

所选色镜必须有效分离激发光和荧光光的波长。具体而言,其透光率截止位于 fluophore 的激发波长和其荧光波长之间二色镜必须通过比较镜子的特性曲线与荧光的波长,镜子放在 45 ° 入射角时发现。
如果 fluophore 的激发波长和其荧光波长关系密切,斯托克城的转变 (注 1) 是小,然后应选择镜像与更小的截止波长,让尽可能多的荧光信号,通过尽可能。

障碍激发块选择

选择一个激发块,允许荧光波长从传递的标本。通常情况下,长时间传输波长长的通激发块都是选择带通激发块。然而,是不会传染这些波长较长的带通激发块是经常用作屏障激发块从一个多重染色标本中分离的波长或使用相机对较长的波长敏感时。

励磁激发块选择

Figure 7

选择一个激发块,允许激发波长下,顺利通过。尤其是当汞灯用作光源,有效的激励被通过线谱的汞灯纳入波长。允许之外的目标荧光传递激发波长的波长将既增加背景光和损害标本。如图 7 所示,激励效率较低的波长为 440 牛米。

组合的屏障激发块和励磁激发块

障碍激发块和激发块励磁的完美结合是一个可以让没有光通结合时。发射的荧光是很弱,所以通过激发块泄漏任何光线会降低图像质量。

获得明亮的荧光图像

有时它被建议删除 ND激发块在励磁光学和增加激发光源的强度。然而,增加激发光源的强度将会快速漂白荧光基团,损害的标本,以及日益增加的自体荧光 (注 2) 的单元格中。基于这些原因,光源应保持尽可能弱和观察光学作出尽可能高效在捡的荧光信号 (通过扩大物镜的孔径,增加波段内荧光滤光片,使用更加灵敏的照相机等)。。

  • [注 1]斯托克城的转变是指激发能量和荧光能量所产生的能量部分损失作为热作为电子落回从兴奋状态中荧光材料其基态之间的能量差。(从岩波书店书店的物理和化学词典)
  • [注 2]自体荧光是指在非那些通常被定义为荧光物质的荧光物质的存在。例如,单元组件 (如 NAADPH 或核黄素给掉在短波长范围内 (紫外和可见) 在不染色细胞相对较强的荧光。

还原漂白工艺

你可以采取以下步骤,以减少漂白。

使用抗漂白的代理

P-苯二胺抗漂白剂可以用于 FITC 和 n-丙基 gallete 可以用于罗丹明。

使用 ND 滤镜

使用中性密度或 ND 滤镜上显微镜以减少光的水平到最起码的观察。有时这可能需要设置的筛选到 100%,同时考虑不分割的光路步骤尽可能多。

使用漂白耐荧光

为每个测试的目的使用可用的最耐漂白剂荧光。