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奥林巴斯显微镜共聚焦的荧光团

2014-07-06  发布者:admin 

 生物激光扫描共聚焦显微镜技术严重依赖荧光作为一种成像方式,主要是由于高度的敏感性提供的技术,结合的能力为专门物镜结构成分和化学固定,以及生活的细胞和组织的动态过程。很多荧光探针都被围绕着设计与生物大分子 (例如,蛋白质或核酸) 绑定或本地化具体结构在区域内,如细胞骨架、 线粒体、 高尔基体、 内质网、 和核合成芳香族有机化学品。其他探测器采用动态过程和本地化环境变量,包括无机金属离子、 ph 值、 活性氧物种和膜电位的浓度进行监测。荧光染料也是有用的监测细胞的完整性 (活与死和细胞凋亡的)、 内吞、 胞吐作用、 细胞膜的流动性、 蛋白贩运、 信号转导、 和酶的活性。此外,荧光探针在分子遗传学领域的遗传映射和染色体分析中被广泛应用。

合成荧光的历史回超过一个世纪到 19 世纪后期,当许多现代组织学的基石染料都是开发探头的日期。其中副玫瑰苯胺、 甲基紫、 孔雀石绿、 番红 O 染色、 亚甲蓝和无数的偶氮 (氮) 染料,如俾斯麦布朗。虽然这些染料高度有色和能够吸收可见光的选定的乐队,多数只是弱荧光,不会有用的几十年后会发展的荧光显微镜。然而,几个合成染料类合成在此期间,基于氧杂蒽、 吖啶杂环系统,被证明是高度荧光和为现代合成荧光探针的发展提供了基础。其中最值得注意早期荧光染料被取代的沢、 荧光素和罗丹明 B 和 biaminated 吖啶衍生物,吖啶橙。

荧光染料作为重要污渍细菌、 原生动物和锥虫,二十世纪早期介绍了荧光显微镜,但没有看到直到 20 世纪 20 年代时荧光显微镜最初是用来研究染料结合固定的组织和活细胞中广泛使用。然而,直到 1940 年代初陈伟业 Coons 开发技术用于标记抗体与荧光染料,因此生育领域的免疫荧光。过去的 60 年里,免疫学和分子生物学的研究进展已产生广泛的二次抗体和提供有针对性的在特定区域内高分子配合物的荧光探针的分子设计的洞察。

荧光探针技术和细胞生物学被大大的绿色荧光蛋白 (GFP) 的发现改变了从水母和发展的突变谱的变种,有非侵入性荧光多色的调查的蛋白质亚细胞定位开门后,分子间相互作用,和贩卖使用活细胞培养。更最近,荧光半导体纳米量子点的发展提供了一条新途径的研究共聚焦和视场荧光显微镜。尽管过去几十年期间所作的荧光染料合成了许多进步,但还有很少有力的证据有关的分子设计规则发展新的荧光染料,特别是匹配到可用的共聚焦激光激发波长的吸收谱。其结果是,荧光共聚焦显微镜中发现普遍使用的数量是已发现的许多数以千计的有限的子集。

荧光团的重要特征

荧光团被编目,并根据其吸收光谱和荧光光谱的特性,包括谱线轮廓,所述波长的最大吸收和发射和发射光的荧光强度。最有用的定量参数表征吸收谱之一就是摩尔消光系数 (用希腊符号ε表示,见图相,是直接衡量一个分子的吸收光的能力。消光系数是有用的吸光度单位转换的摩尔浓度,单位为,由测量 (通常最大值、 吸收物种特征) 参考波长处的吸光度为已定义的光学路径长度的摩尔浓度。荧光染料或荧光量子产率代表荧光发射效率的定量指标的到的光子吸收的数量的光子数之比来表示。换言之,量子产率表示给定的兴奋荧光色素会产生排放 (荧光) 光子的概率。量子产量通常范围内的值为 0 和 1 之间,和荧光分子一般都采用作为探针显微镜有量子产率从非常低 (0.05 或更少) 到几乎统一。一般情况下,高量子产率是可取的大多数成像应用程序。给定的荧光量子产率的变化,有时到大型的极端气候,环境因素,如金属离子的浓度、 ph 值、 和溶剂极性。

在大多数情况下,光子吸收的摩尔消光系数是定量地测量和表示特定波长的光,而量子效率是评估的总集成的光子发射超过整个的荧光谱带 (见图 2(b)))。而不是传统的弧光放电灯与最短范围 (10-20 纳米) 带通干涉滤光片在视场荧光显微术中使用,用于在扫描共聚焦显微镜荧光激发的激光系统限制到特定的激光谱线,其中应包括只有几个纳米的励磁。然而,对于这两种技术,荧光发射谱由类似的带通或 longpass 筛选器,可以覆盖几十到几百纳米的控制。低于饱和的程度,荧光强度成正比的摩尔消光系数乘积和量子产率的荧光,一种关系,可以用来判断排放作为一个功能的励磁 wavelength(s) 的成效。这些参数显示大约 20-fold 的范围中常用的共聚焦显微镜的调查与量子产率从 0.05 到 1.0,流行荧光分子的变异和消光系数的范围从 1 万到 25 万 (摩尔每升)。一般情况下,吸收谱的荧光基团是远少依赖环境条件比荧光发射特性 (光谱波长配置文件和量子产率)。

荧光共聚焦应用程序选择必须表现出的亮度水平和信号足够的仪器,获得没有遭受过度漂白工件和低信号信噪比的图像数据的持久性。在荧光显微镜视场,励磁照度水平很容易受控制的中性密度滤镜和强度可以减少 (耦合期较长发射信号收集的),避免饱和,并削减不可逆损失的荧光。激励条件在共聚焦显微镜中的然而,是更严重的是,几个数量级,荧光特性及效率的显微镜光学系统所施加的限制成为决定励磁率和排放收集战略的主导因素。

激光与电弧放电光谱线
在视场和共聚焦显微镜观察
紫外线 紫罗兰色 蓝色 绿色 黄色 橙色 红色 近红外
氩离子 351、 364 - 457、 477、 488 514 - - - -
Diode - 405、 440 - - - - 635、 640 650、 685
DPSS 355 430、 442 457、 473 532 561 593 638 660、 671
He-Cd 322、 354 442 - - - - - -
Kr-Ar - - 488 - 568 - 647 676
氪离子 - - - - - - 647 676、 752
氦-氖 - - - 543 594 612 633 -
汞弧 365 405、 436 - 546 579 - - -
氙弧 - - 467 - - - - -
金属卤化物 365 435 495 520、 545 575 - 625 685
表 1

由于受雇来激发荧光共聚焦显微镜在狭窄和波长限制激光谱线 (见表 1),荧光发射强度可以严重地限制由于穷人交叠的激发波长荧光基团吸收带。此外,共聚焦针孔孔径,这是获得光学切片在高信号信噪比的关键,是负责 25 到 50%损失的碳排放强度,无论多少的努力上的微调和显微镜光学系统的对齐方式。光电倍增管在共聚焦显微镜,是最常用的检测器,但是遭受随波长 (尤其是在红色和红外的区域),导致进一步的信号的波长依赖性损失跨发射谱函数的量子效率。集体,共聚焦显微镜的光损失可以导致减少的强度超过 50 倍的视场荧光文书中,一般观察到的水平。它应该从前面说的荧光选择是的共聚焦显微镜,最关键的方面之一,器乐效率必须认真考虑,以及,以生产高质量的图像清晰。

在共聚焦显微镜、 荧光分子与在高功率密度的激光聚焦的光束照射增加排放强度达到点的染料饱和,其参数听写的激发的态寿命的一个条件。在兴奋状态下,荧光团都无法吸收另一个入射光子,直到他们发出一个低能量的光子通过荧光过程。当的荧光激发率超过排放衰减率时,分子变得饱和和地面状态人口有所下降。结果,在大多数的穿越,试样的激光能量不减,并不有助于荧光激发。因此,平衡荧光饱和与激光光强水平是实现最佳的信号对噪声比共聚焦实验中至关重要的条件。

数百人,用许多染料具有吸收最大值与常见的激光谱线密切关联运行的共聚焦显微镜荧光探针当前可用的数量。特别是激光线和吸收最大的特异性探针之间的精确匹配并不总是可能的但接近最大值的行的激励效率是通常足以产生水平可以很容易检测到的荧光发射。例如,在图 3 中吸收谱的两个常见探头说明,以及最高效率的激光激发线。绿色光谱是荧光素异硫氰酸酯 (FITC),具有吸收最大值为 495 纳米吸水剖面。在使用氩离子激光的 488 纳米 FITC 荧光激发产生约 87%的发射效率。相反,当使用 477 纳米或 514-纳米氩离子激光线激发 FITC,发射效率降到仅 58%或 28%,分别。显然,488 纳米氩离子 (或氩氪) 激光线是这荧光激发的最有效源。

在图 3 中的红色谱是 Alexa 氟 546,bi 磺化脂环氧杂蒽 (罗丹明) 衍生物与最大消光系数在 556 纳米,这专为在的光漂白荧光实验中水平显著降低显示增加的量子效率设计吸水剖面。Alexa 氟 546 效率最高的激光激发光谱线是黄色 568 纳米线从氪氩混合的气体离子激光器,其产生排放大约 84%的效率。下一个最接近激光谱线,543-纳米线从绿色氦-氖激光和 594 纳米线的黄色氦-氖激光,分别激发 Alexa 氟 546 效率为 43%和 4%。请注意 488 纳米氩离子激光谱线激发 Alexa 氟 546,大约 7%的效率,可以关注当同时进行双重标记实验与 FITC 和 Alexa 氟 546 的一个因素。

归结,通过精心选择的物镜、 探测器孔径尺寸,两色和屏障的筛选器,以及维持在精确对齐的光学火车可以优化荧光发射集合。在大多数情况下,低放大倍数高数值孔径的物镜应该为要求最苛刻的选择成像条件因为光收集强度增加作为第四权力的数值孔径,但只会降低放大倍数的平方。然而,最重要的局限在共聚焦显微镜的光收集效率出现的荧光团本身的物理性能所施加的限制。作为前面讨论的荧光探针发展受限于特定的分子特性负责生产最佳的荧光特征,知识缺乏和设计规则不够,应理解为为指导,以更有效率的荧光团的发展很有帮助。在发展中新的荧光探针能够令人满意,在共聚焦显微镜中目前的成功是性能的通过利用经验数据和分子的结构从现有染料,其中很多第一次合成了一百多年前的性能推断出的假设取得的进展的证明。

传统的荧光染料

共聚焦显微镜荧光探针的选择必须处理仪器来激发和检测荧光发射波长区域由激光系统和探测器提供的特定的功能。尽管当前激光共聚焦显微镜中使用 (见表 1) 产生离散线在紫外、 可见、 和光谱的近红外部分,这些谱线的位置并不总是符合流行的荧光团的吸收最大值。事实上,它是不必要的激光谱线完全吻合荧光波长的最大吸收,但荧光发射的强度由荧光消光系数在激发光波长 (如上所述)。最受欢迎激光共聚焦显微镜是风冷的氩和氪氩离子激光器、 新的蓝色二极管激光器和各种各样的氦-氖系统。总的来说,这些激光器都能够提供励磁十到十二特定波长 400 和 650 纳米之间。

很多的古典的荧光探针已成功地利用多年来在视场荧光,包括荧光素异硫氰酸酯 (见图 1 (a),图 2 和图 3),丽丝罗丹明和德克萨斯红色 (图 1 (c) 所示的结构 ; 光谱图 2 中的),也是在共聚焦显微镜中有用。荧光素是设计过,最受欢迎的荧光染料之一,并享有在免疫荧光标记中的广泛应用。这呫吨染料具有吸收最大值在 495 纳米 (见图 2 (a) 和图 3),正好与 488 纳米 (蓝色) 谱线产生的氩离子和氪氩激光器以及 436 和 467 的主线中的汞和氙弧光放电灯 (分别) 很好。此外,荧光量子产率是很高,这种染料在物理和化学特性方面的特点已收集了大量的信息。消极的一面,荧光素的荧光发射强度严重影响环境因素 (如 ph 值)、 和相对广泛的发射谱与那些其他荧光团在双重和三重贴标实验中经常重叠。

四甲基罗丹明 (TMR) 和异硫氰酸酯衍生物 (TRITC图 4(b)) 经常在多个标签调查在视场显微镜由于其有效的激励采用汞弧光放电灯 546 纳米光谱线。由 543 纳米线从氦-氖激光,但不是由 514 或 568 纳米线从氩离子和氪氩激光荧光染料,其中有大量排放物与荧光素光谱重叠,可以非常有效地激发。使用基于氪激光系统,丽丝罗丹明时最高,在 575 纳米吸收和荧光素及其光谱分离此荧光色素类中更好的选择。罗丹明衍生物的荧光发射强度也不一样依赖于严格环境条件的荧光素。

吖啶染料,在十九世纪,首次分离出的一些有用作为荧光探针在共聚焦显微镜中。最广泛的应用,吖啶橙,包括基本吖啶核与二甲胺基取代基位于三核环系统的 3 和 6 位置 (如图) 所示。在生理 ph 值范围内,分子是在氮杂环类质子化和存在主要作为在溶液中的阳离子种类。吖啶橙强烈绑定到 DNA 之间连续碱基对,吖啶核的插层和展览与最大波长为 530 纳米绿色荧光。探头也强烈结合 RNA 或单链 DNA,但有一段较长波长荧光最大 (约 640 纳米 ; 红色) 当绑定到这些大分子。在活细胞中吖啶橙扩散到细胞膜上 (即为质子化常数),积累了在溶酶体和其他酸性的囊泡。类似于大多数 acridines 和相关多环氮杂环化合物,吖啶橙有比较广泛的吸收谱,使探针,用于与几个从氩离子激光的波长。

另一种流行的传统探头在共聚焦显微镜中有用的是 phenanthridine 导数,碘化丙啶,首次合成作为抗锥虫效果的代理和密切相关的溴化乙锭 (图有赖于。碘化丙啶与 DNA 结合的方式类似于 (通过插层) acridines 生产中心在 617 纳米的橘红色荧光。正电的荧光也有高亲和力的双链 RNA。丙啶在 536 纳米,吸收最大值,可以激发 488 纳米或 514-纳米光谱线氩离子 (或氪氩) 的激光或从绿色氦-氖激光 543 纳米线。染料每每是复染剂在双过程中突出显示细胞核或标记的多个胞内结构的三倍。环境因素可以影响荧光光谱的丙啶,尤其是当染料使用与安装媒体包含甘油。结构相似的溴化乙锭,其中还将绑定到 DNA 通过插层,产生更多的背景染色,因此不像丙啶一样有效。

DNA 和染色质也可以用外部绑定到双螺旋结构的染料染色。在此类别中最受欢迎的荧光染料是 4'、 6-脒-2-苯基吲哚 (DAPI; 见图 1 和图 2) 和指定的数字 33258、 33342 和 34580 双苯甲亚胺Hoechst染料。这些探头是相当水溶性和外部绑定到在富碱基对集群的双链 DNA 小沟与急剧增加中荧光强度。这两种染料类可以由 351 纳米光谱线的高功率的氩离子激光器或 354 纳米线从氦镉激光刺激。类似于 acridines 和 phenanthridines,这些荧光探针作为核复染剂在多色荧光标记协议中使用是最受欢迎的选择。生动的蓝色荧光发射产生巨大反差时耦合到绿色、 黄色和红色探头在相邻的细胞结构。

Alexa 氟染料

现代荧光技术的巨大进步的例子是由分子探针介绍的 Alexa 氟染料 (Alexa 氟是分子探针的注册的商标)。这些磺化罗丹明衍生物更强烈荧光发射比光谱类似展览更高的量子产率进行了探讨,和有几个其他改进的功能,包括增强的光稳定性,吸收谱与普通激光线条、 ph 值不敏感和水溶解度的高度匹配。事实上,Alexa 氟染料的光漂白的抗性是如此富有戏剧性即使受到高强度激光源的照射,荧光强度仍保持稳定,在 antifade 试剂没有相对较长时间。此功能使可溶性 Alexa 氟探头很容易利用活细胞和组织的部分调查,以及传统的固定制剂中的水。

Alexa 氟染料,可在范围广泛的荧光激发和发射波长极大值,从紫外线和深蓝色到近红外区域。个别染料的字母数字名称与特定激励激光相关联或弧光放电灯谱线探针针对的。例如,Alexa 氟 488 (如 5(c)) 专供励磁的蓝 488 纳米线的氩或氪氩离子激光器,而 Alexa 氟 568 568-纳米光谱线的氪氩激光与相匹配的图所示。Alexa 氟染料的几个专门设计用于励磁要么蓝色二极管激光 (405 纳米 ; 见 Alexa 萤石 405 化学结构中图 5(a)),黄色/橙色氦-氖激光 (594 纳米) 或红色的氦-氖激光 (633 纳米)。与传统的汞弧光放电灯中的可见 (Alexa 氟 546) 或紫外线 (Alexa 氟 350,与高功率的氩离子激光器 ; 也有用其他 Alexa 氟染料用于励磁图 5(b)) 和固态红色二极管激光器 (Alexa 氟 680)。由于大量的可用的激发和发射波长在 Alexa 氟系列中的,多个标记实验往往可以完全与这些染料进行。

Alexa 氟染料市面上作为活性中间体的马来酰亚胺、 琥珀酰亚胺酯、 酰肼、 形式,以及编写细胞骨架探针 (共轭对鬼笔,G-肌动蛋白和兔骨骼肌肌肌动蛋白) 和凝集素、 糊精、 链霉亲和、 抗生物素蛋白、 生物胞素,和种类繁多的二级抗体复合物。在后一种形式中,Alexa 萤石荧光团为免疫细胞化学、 神经科学和细胞生物学调查提供了一个广泛的调色板的工具。家庭的探针也已扩展到一系列的染料具有重叠的荧光发射极大值针对复杂的共聚焦显微镜检测系统的光谱成像技术和线性混合像元分解能力。例如,Alexa 氟 488、 Alexa 氟 500 和 Alexa 氟 514 看上去很相似的颜色与明亮的绿色荧光,但拥有不同排放的配置文件。此外,三种荧光染料可以很兴奋与氩离子激光 488 或 514-纳米光谱线,并很容易被发现与传统的荧光素筛选器组合。在多光谱 (x-y-λ; 称为lambda 堆栈) 共聚焦成像实验,光分离软件可以被用来区分之间的相似的信号。重叠的发射谱的 Alexa 氟 488、 500 和 514 都被隔离在单独的通道,并且区分使用伪彩色技术,当三个荧光团同时结合三重标签调查中。

菁染料

菁染料、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy7,和他们的衍生物,最受欢迎的家庭都基于部分饱和吲哚氮杂环核与两个芳香单位正在通过不同碳数的聚烯烃桥连接。这些探头展览荧光激发和发射性能的配置文件类似于许多传统的染料,荧光素和四甲基罗丹明,但与强化的水溶解度、 光稳定性和更高的量子的收益率。菁染料的大部分都是更多比他们传统的同行,渲染其荧光发射强度不太敏感的 ph 值和有机安装媒体环境稳定。方式类似于 Alexa Fluors,Cy 系列的合成染料激发波长的普通激光和弧光放电来源,专门用于调整和传统的筛选器组合,可检测荧光发射。

由大量的分销商销售,菁染料是现成的作为活性染料或荧光团耦合到种类繁多的二级抗体、 糊精、 链霉亲和卵白抗生物素蛋白。菁染料一般有更广泛的吸收谱区域比 Alexa 氟家庭,使他们稍微更加多才多艺的共聚焦显微镜激光激发源的选择的成员。例如,使用氩离子激光 547 纳米光谱线,Cy2 两次是一样有效的荧光发射作为 Alexa 氟 488。以类似的方式,514 纳米氩离子激光线激发 Cy3 具有很高的效率比 Alexa 氟 546,光谱相似的探针。菁染料的排放概况相若的光谱宽度 Alexa 氟系列。

包括在菁染料系列是长波长 Cy5 金融衍生品,都兴奋的在红色区域 (650 纳米) 和远红光 (680 纳米) 波长发出。Cy5 荧光效率很高非常兴奋 647-纳米光谱线的氪氩激光、 633 纳米线的红色氦-氖激光或红色二极管激光器,提供了在激光选择的多功能性的 650 纳米线。因为从传统荧光激发的紫外光和蓝光照明显著移除,发射谱线轮廓,Cy5 是经常利用作为第三个荧光体在三重标签试验。然而,类似于其他探针与荧光发射远红光光谱区域,Cy5 并不是对人眼可见只可以以电子方式检测到 (使用一个专门的 CCD 摄像系统或光电倍增管)。因此,探头很少使用常规视场荧光实验中。

环境的荧光探针

荧光团旨在探讨活细胞的内部环境广泛审查了大量的调查人员,并制定了几百个监视这种作为本地化浓度的碱金属和碱土金属、 重金属 (聘用生化酶的辅助因子)、 无机离子、 硫醇和硫化物,亚硝酸盐,以及 ph 值、 溶剂的极性和膜电位的影响。原来,在这个舞台上实验的重点的波长和强度的吸收光谱和发射光谱展出由后绑定钙离子荧光测量细胞内的磁通密度的变化。这些探头绑定到物镜离子具有高度的特异性产生的测量的响应,通常被称为光谱敏感的指标由光比信号分析的应用程序监视协会平衡离子和它的宿主之间确定离子浓度的变化。这种技术从派生的浓度值大体上是独立的器乐变化和探针浓度波动由于光漂白、 荷载参数和单元格保留。在过去的几年中,一些新的代理商已绑定特定离子或具有可测量的特征响应其他的环境条件。

钙是一种代谢的重要离子在细胞对许多形式的外部刺激的反应中发挥着至关重要的作用。因为钙离子浓度的瞬态波动通常涉及细胞进行响应时,荧光团必须设计测量不仅本地化的浓度在种族隔离的隔离舱,但还应编制数量方面的变化,当磁通密度波整个细胞质的进展情况。许多合成的分子设计用于测量钙的水平基于非荧光螯合剂EGTABAPTA,其中已使用多年,封存在缓冲溶液中的钙离子。两个最常见的钙探针是比率指标 fura 2 和印-1,但这些荧光不在共聚焦显微镜中特别有用。染料的紫外线激发和绑定钙时表现出的励磁或发射谱与形成的等色点的转变。然而,与紫外成像、 有限的标本穿透深度和紫外激光器的费用相关的光学像差有限这些探头在共聚焦显微镜中的效用。

回应在可见范围内钙离子通量的荧光团,不幸的是,并不是比率指标不陈列后具有约束力,虽然他们做进行增加或减少的荧光强度 (典型的 fura 2 和印 1) 波长漂移。最好的例子是一复杂的氧杂蒽衍生物,经历在 525 纳米 (绿色) 的荧光发射急剧增加时所 488 纳米光谱线的氩离子或氩氪激光激发荧光-3。等色点不是目前要保证浓度波动上的没有的因为它是无法确定的光谱变化是否由于复杂地层或与荧光 3 和类似的荧光团的浓度变化。

为了克服缺少波长的变化 (和等色点) 的可见光探针与相关的问题,这些染料的几个常常利用共聚焦显微镜中钙测量相结合。Fura 红色的一种多核的咪唑和苯并呋喃杂环化合物,展品在 650 纳米荧光减少钙在绑定时。当荧光 3 和 fura 红色的混合物兴奋在 488 纳米,衡量荧光的发射极大值处,可以得到对钙离子通量的比例式响应 (525 和 650 纳米,分别) 的两个探头。因为荧光 3 的发射强度的增加而单调,同时 fura 红色的同时减小,等色点当时获得的染料浓度恒定在被调查 (如图 7 所示) 的局部区域内。使用这些探测器在一起的另一个好处是衡量标准 FITC/德克萨斯红色干扰滤波器结合荧光强度波动的能力。

以类似的方式使用类似荧光团进行定量测量的钙、 镁、 钠、 钾、 锌、 等以外的离子。最受欢迎的探头,用于镁,mag fura 2 (结构上类似于 fura 红色),之一也兴奋的紫外范围内和提出同样的问题在共聚焦显微镜观察了作为 fura 2 和印-1。荧光团兴奋在可见光区域正成为可供在不同浓度在细胞基质中存在的很多单价和二价阳离子的分析。几个合成有机探针也已的简单和复杂的阴离子浓度监测。

重要的荧光显示器的细胞内 ph 值包括称为或荧光素衍生物, BCECF,pyranine,芘衍生物,另一种取代氧杂蒽称为羧基窃用 1。因为很多常见的荧光团是敏感的周围介质的 ph 值,通常归因于生物相互作用的荧光强度变化实际上可能发生质子化。在生理 ph 值的范围 (pH 6.8-7.4),如上文所述的探针是双波长比例式测量非常有用,并且仅在染料的加载参数不同。钙离子浓度和 ph 值的同时测量往往可以通过结合 pH 指示剂,如窃用-1,与钙离子指标 (例如,fura-2)。其他探测器已经为 ph 值测量在亚细胞的舱室,如溶酶体,如下所述。

细胞器探针

荧光团针对特定的细胞内细胞器,如线粒体、 溶酶体、 高尔基体,内质网,可用于监测各种生物进程中用共聚焦显微镜的活细胞。一般情况下,细胞器探针由附加到特定于目标的基团,协助本地化通过共价、 静电、 疏水性或类似类型的债券荧光荧光色素原子核组成。很多设计选择细胞器的荧光探针能够渗透或封存在细胞膜内 (和因此,都是有用的在活细胞中),同时必须安装其他使用单克隆抗体与传统的免疫细胞化学技术。在活细胞中细胞器探针是有用的调查运输、 呼吸、 有丝分裂、 细胞凋亡、 蛋白质的降解、 酸性的隔间和膜现象。细胞通透荧光应用包括核函数、 细胞骨架结构、 细胞器检测探头,用于膜完整性。在许多情况下,有带渗透探头贴上标签的活细胞随后可以固定和额外荧光多色贴标实验中用复染。

线粒体探头之间的最有用的荧光团调查细胞呼吸作用是,都经常和其他染料调查采用的多个标签。传统探头、 罗丹明 123 和 tetramethylrosamine,是迅速丢失时细胞固定的很大程度上已经取代了由更新的、 更具体的荧光分子探针由开发。这些包括最受欢迎的 MitoTracker (见图 8(b)) 和 MitoFluor 系列的结构多样性氧杂蒽、 苯并噁唑、 吲哚、 苯并咪唑杂环化合物在各种各样的激发和发射谱线轮廓中可用。其作用机理为每个在这个系列中,从共价键附着到氧化呼吸线粒体膜内探头各不相同。

MitoTracker 染料细胞固定在甲醛后很好保留,并且可以经常承受亲脂性 permeabilizing 代理。相比之下,MitoFluor 探头被专为积极呼吸细胞和不适合固定和染的程序。另一个受欢迎的线粒体探头,题为 JC-1,作为非常有用的膜电位和在多个固定细胞染色实验中的一个指标。这种碳菁染料展品在低浓度时,绿色荧光,但可以进行分子内的协会积极线粒体内产生排放转向 (红色) 波长较长。发射波长的改变是有用在确定活动到非活动在活细胞中的线粒体的比率。

一般情况下,弱的基本胺,能够通过膜调查生物合成和在溶酶体中的发病机制是理想的人选。传统的溶酶体探针包括非特定吩嗪和吖啶衍生物中性红、 吖啶橙,积累后被质子化酸性囊泡。荧光标记的乳胶颗粒和大分子,如葡聚糖,可也累积在溶酶体中通过内吞作用的各种实验。然而,调查共聚焦显微镜的溶酶体属性最有用的工具都是由分子探针开发的 LysoTracker 和 LysoSensor 的染料。这些结构多样性的代理包含调节运输的染料进入的短期和长期的研究活细胞的溶酶体的氮杂环和脂肪族基团。LysoTracker 探头,可用在各种激发和发射波长,具有高选择性,为酸性的细胞器,有能力的标记细胞在纳摩尔浓度。染料的几个保留得很好后修复和细胞的通透。与之相反,LysoSensor 荧光团 (图 8(a)) 设计为研究活细胞中溶酶体功能的动态方面。荧光强度明显增加后质子化,使这些染料 ph 值指标作为有用的 LysoSensor 系列。各种各样的高尔基体特异性单克隆抗体也已在免疫细胞化学检测方法中使用。

蛋白质和脂类进行排序和处理在高尔基器具,通常沾有神经酰胺和鞘脂的荧光衍生品。这些代理商是高度亲脂性,,因此作为标记为脂质运输和活细胞代谢的研究很有用。最有用的高尔基体荧光分子的几个包含由分子探针开发复杂杂环BODIPY原子核。当耦合到鞘脂,BODIPY 荧光是高度选择性和展览一个容忍的是远远优于许多其他染料的光漂白。此外,发射谱是依赖于浓度 (转移从绿色到红色的在更高的浓度),使探头对定位和确定积累大量的脂类的细胞内结构有用。活细胞在试验期间,脂质荧光探针可以进行新陈代谢的衍生品,可以绑定到其他亚细胞的功能,可以经常使实验数据的分析变得复杂的一个因素。

内质网荧光分析的最受欢迎的传统探针分别是碳菁和氧杂蒽染料、 DiOC(6) 和几个罗丹明衍生物。这些染料必须谨慎使用,然而,因为他们也可以积累在线粒体、 高尔基体和其他细胞内的亲脂性区域。更新、 更多的基质,几家制造商已经为选择性染色内质网的探头。尤其是,噁唑家庭成员的 Dapoxyl 产生的分子探针 (见图 8(c)) 是优秀代理商为选择性标记在活细胞中内质网的单独或与其他染料的组合。这些探头与甲醛、 固定后保留,但可能会丢失与 permeabilizing 洗涤剂。另一个有用的探测器是蛋白质的 Brefeldin A,stereochemically 复杂的真菌代谢产物,作为抑制剂从内质网贩运。最后,类似于其他细胞器,单克隆抗体已经开发了这一目标固定细胞的免疫细胞化学调查中内质网。

量子点

纳米级晶体的纯化半导体量子点被称为正在作为潜在的有用的荧光标签代理为生活和固定细胞在传统视场和激光扫描共聚焦荧光显微镜。最近引进的技术使纯化极小的半导体晶体涂层与亲水性聚合物外壳和共轭对抗体或其他生物活性肽和碳水化合物为在很多古典的免疫细胞化学技术协议中的应用。这些探头对有机染料、 荧光蛋白,包括长期耐光性、 高荧光强度级别和多种色彩与排放的所有配置文件的单波长激发有显著的好处。

量子点产生的方式类似于著名的半导体发光二极管照明,但是由吸收一个光子,而不是一种电刺激激活。被吸收的光子与具有较低能量的光子的并发排放创建一个快速重组的电子-空穴对。用于生产生物量子点迄今为止发现的最有用半导体是硒化镉 (CdSe),一种材料的发射光子的能量是纳米晶体颗粒的物理大小的函数。因此,有大小的差异仅在于十分之纳米量子点发出不同波长的光,与发光更短的波长,尺寸较小,反之亦然。

不像典型的有机荧光或荧光蛋白,显示的高度定义的谱线轮廓,量子点具有稳步增加与减少波长的吸收谱。相比之下,荧光发射强度也限于是依赖于圆点的大小,而是独立的激发波长最大波长对称的高峰。结果,相同的发射配置文件观察无论是否对量子点兴奋在 300、 400、 500 或者 600 纳米,但荧光强度大大增加了在较短的激发波长。例如,发出橙色区域 (605 纳米) 典型的量子点共轭的消光系数是约高 5 倍当半导体在 400 600 纳米与兴奋。最大值的一半为典型的量子点共轭的全宽度是大约 30 纳米,和,谱线轮廓不偏向于更长的波长 (具有较高的强度"尾巴"),是这种情况与大多数有机荧光染料。窄排放配置文件可使几个量子点复合物,同时观察到与最低限度的流血,通过。

生物学上的应用,为镉硒化物晶体的相对一致的人口都布满周围的半导体壳组成的硫化锌提高光学性能。下一步的核心材料被涂有聚合物薄膜和其他配体,降低疏水性,提高共轭大分子的附件效率。最终的产品是范围的大小从 10 到 15 纳米,大约有近大蛋白生物活性粒子。量子点复合物作为共同的生物缓冲区中胶体悬浮液增溶,并可能纳入现有的标签协议代替经典染色试剂 (如有机荧光染料标记的二次抗体)。

在共聚焦显微镜,量子点感到激动与不同程度的效率产生的常见的激光系统,谱线的大部分包括氩离子、 氦镉、 氩、 氪和绿色的氦-氖。特别是有效地令人兴奋的量子点在紫外线和紫罗兰色区域是新蓝色二极管和二极管泵浦的固体激光器具有突出的谱线在 442 纳米及以下。405 纳米的蓝二极管激光是经济激励源,是非常有效的使用与量子点由于其高的消光系数在这种波长。使用这些荧光共聚焦显微镜中的另一个优点是在相同的标本,以单激发波长,制作这些探头多个标记实验优秀候选人刺激多个量子点尺寸 (和光谱的颜色) 的能力。

量子点复合物的特殊光稳定性研究是优势的很大在共聚焦显微镜时正在收集光学切片。与有机荧光团的情况下,不同的是位于远离的焦平面标记的结构不要在重复的光栅扫描标本的过程中遭受过度漂白,产量更准确的三维体积模型。量子点复合物在视场荧光显微镜,可供使用的是许多显微镜上的标准设备的常规优化染料的筛选器组合。代以伴随着大多数过滤器集合,从而优化灯能量可以被利用来激发的量子点的带通滤波器 shortpass 滤波器可以进一步加强激励。几个自定义荧光筛选器厂家提供专门设计用于与量子点复合物的组合。

荧光蛋白

过去的几年中,发现和发展的自然发生荧光蛋白和突变的衍生品有迅速先进向中心舞台的活的有机体中的细胞内过程的广泛调查。这些生物探针,为科学家提供可视化、 监视和跟踪单个分子与高的空间和时间分辨率,在稳定状态和动力学实验中的能力。各种各样的海洋生物已经 25 个以上的荧光蛋白的来源和其类似物,手臂向调查人员提供单、 双和多光谱荧光分析的非侵入性生物探针平衡调色板。荧光蛋白在上面描述的传统有机和新的半导体探测器的优势之一是他们对更广泛的各种生物事件和信号的反应。再加上在亚细胞的车厢内,极低或缺席的鲜红斑痣的毒性和广泛的兼容性与组织和完整的生物荧光探针的具体物镜的能力,这些生物大分子提供活细胞成像中令人振奋的新边疆。

本系列的第一位被发现的绿色荧光蛋白 (GFP),从北大西洋水母,水母维多利亚,分离和发现,表现出高度的荧光没有额外的底物或辅酶的援助。在本机的绿色荧光蛋白,荧光基团是丝氨酸、 酪氨酸和氧分子的激活,但不需要额外的辅助因子或酶的甘氨酸三肽衍生物。其后的调查发现绿色荧光蛋白基因可能在其他的生物体,包括哺乳动物,产量显示没有不良的生物学效应的全功能类似物表示。事实上,荧光蛋白可以被融合到几乎任何使用重组互补 DNA 克隆技术,并由此产生在适应标准组织培养方法论的细胞系中表达的融合蛋白基因产物的活细胞中的蛋白质。没有的细胞特异性激活辅助因子需要呈现荧光蛋白作为广义探针比其他生物大分子,如藻胆蛋白,需要插入辅助色素成分产生荧光有用得多。

绿色荧光蛋白与诱变实验产生了一大批的变形与改进折叠和表达特点,其中有消除野生型的二聚化的工件和微调的吸收光谱和荧光光谱的属性。其中一个最早的变种,称为增强型绿色荧光蛋白 (EGFP),包含密码子换人 (通常称为S65T突变),缓解的温度敏感性,增加的 GFP 在哺乳动物细胞中的表达效率。长时间段的最小光漂白,与绿色荧光蛋白融合蛋白可以观察到,在低光照强度。增强型绿色荧光蛋白融合产品都是以最佳方式兴奋,氩和氪氩离子激光共聚焦显微镜在 488 纳米光谱线。这提供了一个极好的生物探针和仪器组合检查胞内蛋白通路和细胞器和细胞骨架结构的动态变化。

额外的突变研究发现了绿色荧光蛋白变异,横跨整个可见光谱区,表现出各种吸收和排放特性,使研究人员开发出同时观测两个或更多不同荧光蛋白在一个单一的有机体中的探针组合 (见图 10 中的谱配置文件)。早期的调查产生的蓝色荧光蛋白 (BFP) 和蓝绿色荧光蛋白 (CFP) 突变体从转移吸收和发射谱线轮廓的野生型 GFP 低波长区域的简单氨基酸替换。使用与绿色荧光蛋白的组合,这些衍生品都是有用的共振能量转移 (烦恼) 实验和其他依赖于多色荧光成像技术的调查。蓝色荧光蛋白可以与 354 纳米线从一种大功率氩激光器,有效地兴奋时的更多有用的青色导数非常兴奋,紫色和蓝色激光线,包括 405 纳米的蓝二极管、 442 纳米氦镉的谱线和从标准的氩离子激光 457 纳米线的数目。

GFP 晶体结构分析到红移的吸收和发射谱的基础上,设计了另一种流行的荧光蛋白衍生物,黄色的荧光蛋白 (YFP)。黄色荧光蛋白以最佳方式非常兴奋,氩离子激光、 514-纳米光谱线和提供更强烈的辐射比增强型绿色荧光蛋白,但对低 pH 和高卤素离子浓度更敏感。增强型黄色荧光蛋白衍生物 (EYFP) 是有用的 514 氩离子激光线,但也可以激发效率相对较高的 488 纳米线从氩和氪氩激光器。这些衍生产品已被广泛应用于蛋白质-蛋白质的荧光蛋白的烦恼与 CFP,结合调查和此外,已经被证明可以涉及多蛋白质贩卖人口的研究。

企图转移到波长在光谱的橙色和红色区域的吸收光谱和发射光谱的水母维多利亚荧光蛋白会见了小小的成功。但是,从其他海洋物种的荧光蛋白有启用扩展的可用光谱区域内的红色波长范围之内的调查人员。红色荧光荧光蛋白和其衍生物,原本分离的海葵Discosoma 芨,是目前最受欢迎的类似物为 575 650-纳米区域的荧光分析。另一种蛋白, HcRedHeteractis 皱紫色银莲花,也是调查更长的波长在可见光谱的有希望的候选人。新研制的活化荧光蛋白,包括光激活绿色荧光蛋白 (GFP PA)、和点燃荧光蛋白 1 (KFP1),表现出明显的改善在绿色荧光蛋白 (达几数万倍) 荧光强度的刺激下紫激光照明。这些探头应证明有用在荧光共聚焦研究中涉及的特定物镜区域选择性照射和扩散型流动的随后的动力学分析和融合蛋白的分室居住时间。

淬火和光漂白

淬火和光漂白的后果是遭受了几乎所有形式的荧光显微镜和结果在有效地减少废气排放的水平。这些工件应在设计和执行荧光调查时主要考虑。这两种现象是不同的淬火通常是可逆的而不是光漂白。淬火产生诱导非辐射松弛 (没有光子发射) 的激发的态电子对地面状态,这可能是分子内或在大自然中分子间的竞争进程有多种。非辐射跃迁通路与荧光松弛竞争,因为他们通常极大地降低,或在某些情况下,完全消除废气排放。最猝灭过程采取行动,减少的激发的态寿命和受影响的荧光量子产率。

淬火的一个常见示例被观察与激发的态荧光基团与在解决方案中,从而导致失能的荧光基团和返回到地面状态的另一种 (非荧光) 分子的碰撞。在大多数情况下,分子的既不是化学方式改变的碰撞的淬火工艺。简单的元素和化合物的种类繁多的行为作为碰撞猝灭剂,包括氧气、 卤素、 胺和许多缺电子有机分子。碰撞淬火可以揭示本地化猝灭剂分子或基团,其中通过扩散或构象改变,可能会碰撞与荧光基团在激发的态寿命期间的存在。碰撞淬火的机制包括电子转移、 自旋-轨道耦合和系统间穿越到激发三重态的状态。经常与碰撞猝灭交替利用其他条款都是内部的转换和动态猝灭。

第二个类型的猝灭机理,称为静态复杂淬火,而产生的非荧光配合物荧光的猝灭剂之间形成,有助于限制通过减少人口的活跃,易激动的分子吸收。这种效果荧光物种形成一个可逆的复杂的猝灭剂分子在地面状态下,并不依赖于扩散或分子碰撞时发生。在静态猝灭,而不会改变的激发的态寿命减少荧光发射。荧光体在兴奋状态也可以通过在接近的接近度与受体分子的激发的态能量可以被转移往的非辐射时的偶极共振能量转移机理淬火。在某些情况下,淬火可以通过非分子机制,如对入射光的吸收的物种 (包括发色团本身) 的衰减。

与淬火、漂白(也被称为衰落) 荧光永久失去的能力由于光子诱导化学损伤和共价修饰的荧光时发生。后从激发的单线态过渡到激发三线态,荧光团可能会与另一种分子产生不可逆的共价修饰进行交互。三重态是单线态状态,从而使激发的分子更长的时间,让与环境中的组件发生化学反应相对较长的寿命。激发和发射周期发生的特定的荧光光漂白前的平均次数是取决于分子的结构和当地的环境。一些荧光快速漂白后发射仅有几个光子,更健壮的其他可以进行数千或甚至数以百万计的周期漂白前的同时。

图 11 中是漂白 (渐弱) 观察到一系列的数字图像捕获不同时间点乘以沾文化印度麂鹿皮成纤维细胞中的一个典型例子。在原子核上沾满 DAPI (蓝色荧光),而线粒体和肌动蛋白细胞骨架上沾满 MitoTracker 红色 (红色荧光) 和 Alexa 氟鬼笔导数 (Alexa 氟 488 ; 绿色荧光),分别。在两分钟的时间间隔使用荧光筛选器相结合,利用带宽调整,以激发三个荧光团同时也录制联合的发射信号的同时采取了时间点。请注意所有三个荧光强度相对较高在图 11 (a),但 DAPI (蓝色) 强度开始下降迅速在两分钟内和在六分钟几乎完全消失。线粒体和肌动蛋白的污点是更耐光漂白,但强度的两滴定时序列 (10 分钟),当然。

一类重要的光漂白事件是鲜红斑痣,意思它们涉及的荧光光与氧的结合与互动。荧光团和氧气分子之间的反应永久破坏荧光和产量化学可以修改其他分子在活细胞中的自由基单线态氧。由于事件的鲜红斑痣光漂白的量是分子氧浓度和荧光基团,氧分子和其它细胞组分之间的近端距离的函数。通过限制到照明荧光团的暴露时间或降低的激发能量,可以减少光漂白。然而,这些技术也减少可衡量的荧光信号。在许多情况下,荧光团或细胞悬浮液的解决方案可以去氧,但这是不可行的活体细胞和组织。也许对抗光漂白的最好保护是限制接触的荧光素强光照条件下 (使用中性密度滤镜) 加上商业上可用的 antifade 试剂,可以添加到安装的解决方案或细胞培养基中明智地使用。

在某些情况下,光漂白效果也可以用于获取特定信息,否则不可能获得。例如,在荧光恢复后漂白 (FRAP) 实验中,在目标区域内的荧光团故意是与过量的照射漂白。作为新的荧光分子扩散到漂白区域的标本 (恢复),荧光发射强度被监测以确定目标荧光基团的侧向扩散率。以这种方式,可以确定平移的荧光标记分子流动性内非常小 (2 到 5 微米) 区域的单个单元格或一条活的组织。

结论

虽然都是有利的共聚焦显微镜的荧光团的子集发展迅速,已多年在视场应用中有用的传统探头的很多人仍然是小实用程序时由固定波长的激光谱线的约束。许多人围在紫外区激发的荧光团使用的限制将被淘汰与先进目标旨在减少像差耦合到逐步推行低成本、 高功率二极管激光系统的谱线在这些更短波长的介绍。405 纳米的蓝二极管激光是更昂贵的离子和基于惰性气体的紫外激光器,一个相当便宜的替代和正在迅速成为最共聚焦显微镜系统可用。氦-氖激光的光谱线在黄色和橙色区域已呈现一些荧光团有用了以前只限于视场的应用程序。此外,正在采用新的二极管泵浦固体激光器发射波长的紫外线、 紫罗兰色,和蓝色区域。

继续取得进展荧光设计、 双激光扫描、 多光谱成像和旋转磁盘应用程序也将在未来几年中重要。排放交叉谱重叠,与许多合成的探针和荧光蛋白在多色调查,效益显著从谱分析法和反褶积的 lambda 堆栈中发生的现象持续存在的问题。相结合,这些进展,将会大大提高收集和分析从活细胞成像中的复杂荧光实验获得的数据。