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奥林巴斯显微镜荧光共聚焦显微镜中的共定位

2014-06-27  发布者:admin 

 在考试和数字录音的乘法标记荧光标本、 两个或更多的排放过程中信号往往可以重叠的最终形象因他们接近的接近度内的微观结构。这种效应被称为定位,通常发生时标记的荧光分子将绑定到躺在非常接近或相同的空间位置的物镜。高度特异性的现代合成荧光和古典免疫荧光技术,加上精密光学切片和数字图像处理马力共聚焦和多光子显微镜,所提供的应用极大地改善生物标本中检测定位的能力。

共定位,在生物的表现形式,是由居住在标本中的同一物理位置的两个或更多不同分子的存在而定义的。范围内的组织切片、 单个单元格或在显微镜下查看的亚细胞细胞器,定位可能表明分子都连接到的相同的受体,但是,在数字成像技术,是指发出的荧光分子共享相同的像素在图像中的颜色。在共聚焦显微镜标本被记录作为数字图像组成的一个多维数组,包含很多体积元素称为体素表示三维像素为单位)。体素 (或检测卷) 的大小是由物镜、 照明波长和共聚焦检测仪针孔直径的数值孔径确定的。因此,定位在一个标本,例如 Alexa 氟 488 有两个荧光探针的绿色发射和 Cy3 与橘红色的排放,是在图像中以像素表示的含 (经常产生各种色调的橙色和黄色) 这两个红色和绿色的颜色捐款。

作为一个例子,给出了在图 1 中的图像序列说明了在横向光学平面 (x-y轴在激光扫描共聚焦显微镜)纽蛋白,与粘着和黏着路口相关蛋白与细胞骨架蛋白肌动蛋白的定位。这些配合服务作为肌动蛋白微丝的形核部位和外部介质、 质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的交联剂。图 1 (a) 从 Alexa 氟 488 (丝状肌动蛋白) 兴奋与 488 纳米氩离子激光器是从探测器通道发射谱的 Alexa 氟 568 (纽蛋白) 进行筛选,当兴奋 543 纳米氦-氖激光,而图 1 (b) 是经过筛选后收集荧光发射的渠道收集的扫描。数字相结合的两幅图像 (图 1(c)) 显示的两个荧光信号在丝状肌动蛋白纤维的总站共定位。

它是重要的是注意到那定位不是指的可能性,与类似的发射谱的荧光团将出现在相同的像素设置在复合图像中。准确定位分析是唯一可能如果荧光发射光谱要很好地与分离之间荧光团,正确的筛选器集 (或光谱狭缝宽度),使用期间的习得顺序。如果谱的流血,通过工件存在因为一个高度光谱之间的重叠荧光发射谱,或由于使用了不正确的筛选器组合,共定位测量将变得毫无意义。为了避免工件,荧光分子必须仔细相匹配照明源 (共聚焦显微镜在激光线) 的功率谱,同时仍保持有用程度的发射波长之间的分离获得的最大激励效率。在大多数情况下,荧光共定位分析的明智选择中获得满意的结果至关重要。

在图 2 中,提出了一种比较光谱重叠为一系列的 Alexa 氟染料组合在定位实验中可能会有用。所有的发射谱的比较,正常化,重叠区域由灰色底纹的指示。在图 2 (a),为绿色荧光 Alexa 氟 488 和橘黄色荧光 Alexa 氟 555 染料发射谱表明峰值波长,通过人的眼睛也很容易区分的清晰分离。然而,光谱互相重叠 (灰色阴影区域) 的适度水平说明了,有相当多的排放量从 Alexa 氟 488 发射波长峰值在 Alexa 氟 555 (由一条黑线从发射峰跑到横坐标表示)。这种高水平的信号流血,通过呈现分离的探头在 Alexa 氟 488 的荧光发射强度明显大于 Alexa 氟 555,会发生大量的因素,包括荧光物镜人口较大差异的情况下很难。结果,这些探头的组合应该避免定位在实验中,或使用只有当图像在同时加工方面的共聚焦模式下,以减少或消除流血,通过获得。

Alexa 氟探针之间的光谱重叠随发射极大值之间的带宽增加,如图 2 (b) 所示。在这种情况下,Alexa 氟 488 和深红色荧光 Alexa 氟 633 表现显著降低的程度的重叠时相比,图 2 (a)。这两种染料很容易区分对人的眼睛和光谱重叠的程度低应该效果不好与最小流血,通过定位在实验中,条件是每个探头的浓度是类似 (请注意,Alexa 氟 633 的深红色荧光可能很难想象通过显微镜目镜在低浓度时)。Alexa 氟 633 由 633 纳米线的红色氦-氖激光,最有效地激发,但也可以用黄色的氦-氖激光的 594 纳米线。也许最好的光谱分离中可见发光 Alexa 氟染料是 Alexa 氟 488 和 Alexa 氟 647 (不说明) 的结合。这些染料之间几乎没有光谱重叠和流血,通过工件应该是缺席,甚至含有过多的标本中各级 Alexa 氟 488。荧光探针具有这些特点是配备了适当的激光共聚焦显微镜的共定位调查的理想人选。

决定定位在共聚焦显微镜观察的能力被有限的光学系统的分辨率和用于照亮试样的光的波长。视场荧光和共聚焦显微镜具有理论分辨率大约 200 毫微米 (0.2 微米),但在实践中,这个数字下降到 400 和 600 纳米的各种原因,包括显微镜、 折光指数波动、 光学畸变和不当的试样制备的不同心度之间的一个值。在几乎所有情况下,然而,完美调谐的共聚焦显微镜的光学分辨率限制并不足以确定两个荧光分子是否附加到一个单一的物镜或是否他们甚至驻留在相同的细胞器。高度特异合成探针或抗体靶向本地化和定义良好的细胞结构,很容易受歧视的周围设计了很多实验协议。其他人产生标本与显示探针之间的重叠程度高的地区。

对于是小于 5 微米的厚度,如贴壁细胞或非常薄的组织切片的标本定量定位分析往往是可能的在常规视场荧光显微镜。然而,对于较厚的标本,图像应记录作为光学切片的有限的轴向尺寸,以确定是否看似让出荧光团实际上驻留在同一侧的焦平面或他们是否垂直叠加超过对方沿显微镜z-轴。荧光团厚厚的标本中的共定位分析应由获得使用激光扫描或旋转磁盘共聚焦或多光子显微镜光学切片。多光子仪器往往能够激发这两个荧光双标记标本中与单一的近红外激光谱线在焦点的物镜高度定义卷中。这个独特的功能限制到居住只在焦平面,这将大大减少光漂白工件和背景噪音的荧光的荧光发射。

共定位分析软件

荧光共定位在一个标本的程度被衡量通过比较中获得的图像的每个的等效像素位置的颜色值。在分析过程中的第一步涉及到将赖以进行定位测量,无论是从两个独立的通道单波长并购 (首选技术) 或乘法标记的样品作为一个单一的形象获得派生复合材料作为图像显示。检查时有两个以上的标签的标本,在一个单一的计算,期间处理的只有两个 pseudocolors,但所有的伪彩色排列可以随后被选为对的共定位分析。通常情况下,由于传统使用的氩离子、 氩、 氪和氦-氖激光,有谱线能够有效地令人兴奋的强烈吸收在蓝色和绿色区域的荧光共聚焦荧光选择红绿双。此外,人类的眼睛是绿色和红色的颜色组中的色调更敏感。

共定位分析的 pseudocolored 的标本图像图形显示方便代表由散点图(有时称为fluorogram),与相关的关系或两个数据集之间的关联。一个散点图图的一个伪彩色 (或通道) 与另一个用于每个像素在图像中,强度或所选的区域的利益,在二维直方图上 (见图 3 和图 4)。一个通道 (通常是绿色的) 用图表表示沿x-轴,而其他 (通常为红色) 在y上绘制-强度从 0 到 255 的横坐标和纵坐标轴。因此,由一对强度作为坐标可分辨的特点复合图像每个像素是在笛卡尔坐标系统中。由的强度对生成的分布格局的分析可查明的荧光共定位,以及背景歧视、 流血,通过、 漂白和缺乏登记之间的各个通道。

图 3 显示了三个双通道共聚焦显微镜光学切片图像平面 (pseudocolored 红色和绿色) 从标本有不同程度的荧光共定位,以及其相应的散。有非常低强度每个通道中的像素位于原点 (0,0) 附近的散点图,亮的像素被分散远和跨整个关系图。在红色和绿色通道关联一个散点图,纯红色和绿色像素为单位) 倾向于集中附近的轴的情节,而让出像素为单位),如果存在,出现彩色与橙色和黄色色调 (取决于定位的程度),与落在中心附近 (x = y) 和右上角的散点图。

图 3 给出了的标本包括大鼠大脑海马冠状厚断面标记有 Alexa 氟 488 (神经丝) 和 Alexa 氟 568 (胶质纤维酸性蛋白 ;胶质纤维酸性蛋白,图 3(a))。印度麂鹿皮肤成纤维细胞染色 Alexa 氟 568 靶向纽蛋白和 Alexa 氟 488 共轭对鬼笔 (丝状肌动蛋白) 中说明了图 3 (b),而兔肾上皮细胞 (RK 13行) 共同表达荧光蛋白,DsRed 和 EYFP,定位于细胞核,描绘在图 3 (c)。关联的散位于下方的标本图像 (例如,图 3 (d) 是为图 3(a)) 的散点图和定位两个通道的程度由白色字母和数字在左下角的每个散点图。在图 3 (a),并逐步更高程度的定位功能系数的大约 30 % 和 85 %,分别在图 3 (b) 3 (c),注意到相对缺乏的定位 (只有两个通道的一对夫妇 %)。

散点图分析荧光共定位使用的典型软件提供的共聚焦显微镜及成像程序制造商的售后所显示的图像在图 4 中,这使用印度麂碱性成纤维细胞细胞染色与 Alexa 氟 568 (纽蛋白 ; 红色通道) 和 Alexa 氟 488 (丝状肌动蛋白 ; 绿色通道) 生成的序列概述。感兴趣区域的选择是为分析在散点图,如图 4 (a) 中的白色矩形由表示。这一地区设置门槛水平的信号,将包括在大多数定位软件程序所进行的分析。

概述了感兴趣的领域的水平和垂直边缘应保持一致,要排除背景信号,聚集沿x轴和y-轴的散点图。仅从包含在所选区域的边界内的像素所产生的信号分析的定位估计。试样中的像素区域重叠容易转换成一个定位二值化阈值掩码 (图 4(b)),可以叠加在图像 (图有赖于作为定位地图。地图图 4 (c) 所示的阈值部分显示让出的领域在白色的但这种颜色可以随时改变与大多数软件应用程序到生产更高程度的对比与原始的 pseudocolors 的另一种颜色。

如上所述,使用从散获得和所选的信息可以获得定量评估的荧光定位在共聚焦光学切片的感兴趣区域。几个值生成使用的整个散点图的信息,而其他人都来自像素值包含在所选区域感兴趣。用于分析的变量之间的整个的散点图是重叠的皮尔逊相关系数 (),是重叠的为了描述的两种模式之间度匹配到另一个图像模式识别中的应用的标准技术之一。皮尔逊相关系数是根据公式计算的:

(1

S1在哪里像素为单位) 中的第一渠道和S2的信号强度是信号强度的第二个通道中的像素。S1(average)S2(average)的值分别是第一和第二次的通道中的像素的平均值。在皮尔逊的相关性,从原始的强度值中减去平均像素强度值。其结果是,此系数的值范围从-1 到 1,值为-1 表示完全缺乏从图像,像素和的值为 1 指示完美图像配准之间的重叠。皮尔逊相关系数仅占形状两个图像之间的相似度,并不取决于图像的像素强度值。当将此系数应用于共定位分析,然而,潜在的负面值是难以解释,需要另一种办法来澄清分析结果。

更简单的技术往往被用来替代的相关系数计算涉及到消除减法的平均像素强度值从原来的强度。定义正式的重叠系数 (R),此值范围介于 0 和 1 之间,则对图像分析中的强度变化不敏感。重叠系数的定义为:

(2

通道强度在分子中的产品返回一个值,显著,只有当两个值都属于一个像素所涉及的共定位 (如果这两个强度大于零)。因此,方程(2)的分子是成正比的 colocalizing 的像素数。以类似的方式,重叠方程的分母是成正比的像素数从这两个组件在图像中,不管是否存在定位 (注:组件的定义的红色和绿色的图像或像素阵列从通道 1 和通道 2,分别)。重叠系数的一个主要优势是其对各种组件的形象,往往产生的荧光染料浓度波动、 漂白、 量子效率变化和非等效电子通道设置,信号强度差异的相对不敏感。

使用重叠系数的最重要的缺点是比率的每个通道中的图像特征的人数之间的强大影响力。为了减轻这种依赖关系,重叠系数被划分成两个不同分项系数,称为k(1)k(2)表达的共定位程度作为两个独立的参数:

(3

重叠系数、 k(1)k(2),描述强度之间的渠道,与k(1)正在敏感中的通道 2 强度的差异 (绿色信号),而k(2)线性依赖于从通道 1 (红色信号) 像素的强度的差异。到目前为止所描述的方程是重叠的能够产生程度有关的信息和可以帐户的强度变化之间的颜色通道。为了估计在让出领域整体量让出荧光图像的一个颜色通道的贡献,一组额外的共定位系数、 m(1)m(2)的定义:

(4

共定位系数m(1)被采用描述让出的地区,从通道 1 贡献系数m(2)是用来描述从通道 2 同样的贡献。请注意变量S1(i,coloc)等于S1(i)如果S2(i)是更多比零,反之为变量S2(i,coloc)这些系数是荧光复合图像,相对于该通道中的总荧光每个通道中的 colocalizing 荧光团的数量成正比。即使时在两个图像通道的信号强度有明显不同的层次,共定位系数m(1)m(2)是可以确定的。

共定位系数第二双可以为像素强度范围划定在散点图上的感兴趣的区域由定义的计算。系数M(1)被用于描述信道 1 荧光让出的区域,所作的贡献,而M(2)用来描述信道 2 荧光基团所作的贡献。这些定位系数的定义如下:

(5

在哪里S1(i,coloc)等于S1(i) ,如果S2(i)在于兴趣阈值 (左、 右两边的矩形 ROI) 的区域内和等于零,如果S2(i)表示一个像素以外的阈值水平。同样, S2(i,coloc)等于S2(i) ,如果S1(i)在于兴趣阈值 (顶部和底部两边矩形 ROI) 的区域内和等于零,如果S1(i)感兴趣的区域外。换句话说,对于每个通道,分子表示也有一个组件从另一个通道,该通道中的所有像素强度的总和而,分母表示所有强度的总和从通道。这些系数是 colocalizing 中的对象的每个通道的复合图像,相对于该通道中的总荧光荧光的量成正比的。

商业上可用的定位软件分析程序的大部分是能够计算出的参数,上文所述,包括皮尔逊相关系数、 总重迭系数,以及个别k(x)字母字母定位系数。另外,许多程序都包含应用背景减法校正,生成的整个形象,散和/或执行单一的双通道复合图像或沿轴向平面光学堆栈上使用选定的感兴趣区域的计算的算法。最重要的数据输出,从这些软件包是重叠的的共定位系数、 指示信号之间的相对程度。例如,定位系数值为 0.75 的荧光体在通道 1 表示有一个通道 2 组件,除以所有通道 1 强度,总和的所有通道 1 强度的比例是 75%。这是定位的相对较高。同样的值为 0.25 为通道 2 荧光指示定位 (等于三分之一的通道 1 荧光) 显著降低的的级别。

文物和标本共定位分析中考虑的因素

共定位分析时遇到的最重要的文物中是光谱流血,通过发射谱重叠、 自体荧光 (主要是在组织标本),和特异性抗体或合成荧光染色。荧光共振能量转移 (烦恼) 也是一个潜在工件与让出荧光团有紧密的重叠谱线轮廓。这些工件的任何有能力生产图像像素出现黄色或橙色,但不是来自共定位,检查标本用绿色和红色荧光探针标记。

也许最常见的问题是流血,通过荧光强度的时成像具有两个或更多的荧光标签的标本。例如,当双标记与传统的绿色和红色探头,荧光素和罗丹明,流血,通过只可以通过使用优化的荧光筛选器设置,减少,但永远不会完全消除了。这种效应是重叠的由于这样一个事实,这些染料有很广泛的吸收光谱和发射光谱,表现出很大程度。因此,激发荧光使用氩离子激光器 488 纳米光谱线也将产生励磁罗丹明,虽然程度较轻。此外,荧光发射将设置预留罗丹明,生产出现黄色或橙色甚至在定位缺席的情况下的像素的光电倍增管通道或视场筛选器中检测到。为了进行这些的定位实验和类似荧光团,流血,通过工件必须完全消除。

与流血,通过在传统荧光团 (如荧光素和罗丹明) 相关的问题通常可以通过使用更新的生物学上的改进和光明合成探测器,如 Alexa 氟家庭或碳菁 (Cy 系列) 染料克服。许多这些专门设计的有机分子的陈列很窄的发射谱 (相比于传统的探头),恰逢弧光放电灯的大消光系数和激光光谱线、 改进的量子产率、 减少的漂白和荧光排放对环境变量的更少依赖。此外,这些先进的探头均可提供激励谱线,横跨大约 400 纳米,从紫外到近红外,确保各种各样的选择,以配合照明光源与最小排放光谱重叠带宽。

荧光,显著得多用甲醛固定组织标本,产生类似的外观,以流血,通过工件。励磁常常展出自体荧光试样的结果在检测中排放的其他渠道,产量似乎已经让出荧光团的图像。过度背景染色的抗体和合成荧光团也可以像在那里两个荧光团都表现出高度的非特异性染色的区域定位。这个工件可以通常会避免或者,至少,大大减少通过仔细制备样品和监测议定书 》 与适当的控制。

共定位调查所有流血,通过、 自体荧光和非特异性荧光工件已经被淘汰,每次只可以考虑准确。最有效的办法是聘请序贯励磁在共聚焦显微镜扫描配置,以收集与窄带发射筛选器 (或窄缝宽度为分光仪器) 发射信号。同时,应检查单标记控制标本,以确保完全消除的流血,通过和未染色的控件可以有效地监测自体荧光。流血,通过校正软件是可用于很多的共聚焦显微镜,使校正而被捕获的图像。

为各种标本,说明在图 5 中流血,通过工件及他们在激光扫描共聚焦显微镜的更正。在图 5 (a) 提出了一种对成纤维细胞描绘流血,通过 Alexa 氟 488 (绿色荧光) 的进 MitoTracker 红色 (红色荧光) 打算当标本与氩离子 (488 纳米光谱线) 和绿色氦-氖 (543 纳米线) 激光扫描,同时产生黄色肌动蛋白微丝的通道。序贯扫描和检测 (图 5(d)) 流血,通过消除了。同样地,流血,通过在厚厚的小鼠肠道 (图 5(b)) 发生与同时扫描使用 Cy3 和核探针,DRAQ5,加上绿色和红色的氦-氖 (633 纳米线) 励磁。按顺序扫描标本 (图 5(e)) 中删除伪装成共定位的流血,通过工件。

 

在哪里使用超过两个的激光扫描多标记的标本的情况下,流血,通过工件通常可观察到几个频道,数字披露和 5 (f) 为的厚厚的 Alexa 氟 488 (神经丝)、 Alexa 氟 568 (GFAP) 与 DRAQ5 标记的大鼠脑中所示 (核)。流血,通过时,会出现第二和第三渠道标本被同时扫描与三个激光器 (图 5(c)),指示潜在的共定位之间在这标本的中间丝。然而,在启动顺序扫描和数据收集,时花丝只出现在他们各自的渠道 (图 5(f)),消除的荧光定位在这些结构中的注意事项。

荧光共振能量转移,从理论上讲可以测量短的距离之间两个密切定位荧光团,也是非常有用的工具,用于监测定位。然而,这种现象可以经常导致工件共定位分析期间除非必要的 FRET 的具体参数是很好理解,仔细考虑在实验的设计过程中。具体而言,调查人员应该关注的时候使用探针有谱线,占领相同的带宽,特别是在那里的第一次的荧光发射谱与激励谱的第二个重叠的区域。这些标本的能量转移被表现在从第一个荧光基团和类似的意外增加荧光发射意外下降为第二个探测器的排放强度。密切相关的荧光团之间的互动也可以导致淬火的发射的荧光信号,取决于环境条件。

经过认真的样品制备技术可以规避的许多潜在工件定位分析中。如上文所讨论,应选择荧光探针,广泛有最小的重叠分离发射谱线。如果可能的话,选择绿色的荧光,有一个狭窄的排放标本 (如 Alexa Fluors 或量子点) 和深红色或近红外区域发出红色荧光。小学和中学的抗体必须测试的交叉反应性非特定背景染色。应优化加载合成荧光团和标记二级抗体的浓度,以确保类似的亮度水平,尤其是当物镜丰度是完全不同。影响荧光亮度因素是激发效率、 量子产率、 消光系数、 浓度、 以及环境因素,如 ph 值、 离子浓度、 疏水性、 和粘度。对照标本应该也准备与每个荧光基团分别和分别为流血,通过分析和自体荧光表征染色的缺席。仔细注意小细节,在染色的协议将会减轻康复通过收购后加工算法的数字图像的必要性。

实践方面的共定位分析

在审查和分析复杂的荧光图案,采用联合伪彩色显示是非常有用,因为已在上文叙述的。通常情况下,两个颜色通道被选中,最常见的是绿色和红色的所以,重叠区域出现黄色。其他颜色配对,如蓝色和绿色 (高产青色) 和蓝色和红色 (产生洋红色),还可采用,却是少得多有效的视觉检查减少人眼对反射蓝色波长的敏感性。然而,在许多情况下,特别是与三色图像,使用蓝色通道伪彩色是不可避免的。

在规划中的图像采集与显示参数,应采用标准以便合并的图像表现出相同的动态范围和每个荧光信号偏移量。事实上,标准共聚焦显微镜观察实践表明这种方法为所有日常样品分析。一旦结合,重叠的红色和绿色信号如果收集了足够的光子会产生明确的亮黄色信号。光子饿在实验中,所产生的暗黄色色调让出荧光团,与平等贡献的绿色和红色的背景将出现棕色。

应分别调整每个通道的偏移和增益控制 (的背景设置为零和饱和度到 255),每个荧光显示使用完整的 8 位 (256 灰度级) 范围。然后能够处理和合并单独的图像。虽然这是一种方便的方法来获取和显示彩色图像,试样中的两个信号的相对振幅不能确定,因为每个信号的收购来填充图像的整个位深度。因此,给定的颜色通道内的相对信号强度的分析将需要的渠道,进行配置以类似的方式在光电倍增管电压、 增益和偏移量的问候。

如果不平衡的采集和处理的技术,关于合并后的彩色图像中定位不准确解释可以导致从不当增益和偏移量的配置的光电倍增管期间采集或由于极端直方图拉伸图像处理过程中。例如,如果黑级 (偏移) 值太高,不同的颜色分割可以发生低的黑色级别设置和降低的对比度条件下观察,在相同的结构。为关键的应用程序,可以应用比率成像技术来区分,是让出的信号和信号,只是部分地重叠。

完美对齐的荧光成像系统将作为精确地注册,像素的像素,在使用不同的筛选器集时,探测器图像试样中的点源。然而,工件如不足颜色校正的物镜或差对齐的过滤器可以导致丢失注册期间颜色合并,荧光信号之间的经常辨认颜色的均匀位移。对于具有复杂的图案和混合物的明亮和昏暗的信号的图像,这种效应可以去未被发现,从而导致信号结构的分布是不同或部分重叠的结论。

位移伪影可以减轻 (操作被称为平移) 的图像处理过程中的合并后的图像恢复注册使用许多可用的软件包。对齐一组颜色层通过平移的能力需要在标本中的每一层都存在重合参考点的存在。如果乘沾上的参考点不存在,多色荧光乳胶微球可以添加到在高稀释收益每人学视域与盖板玻璃安装前的几个珠子的标本。为关键的应用程序,单个筛选器集与多带通二向色镜和障碍筛选器可用于不同的激光或特定于荧光染料的激发过滤器所有的荧光信号。这种配置在共聚焦显微镜中使用,适用于视场荧光色彩校准在哪里是关键。

在图 6 中所示是几个上文讨论过的常见工件常常妨碍准确定位分析标本用多个荧光团 (请注意在图 6 中的所有荧光组合都发出只有绿色和红色荧光) 标记中。人类女性骨肉瘤上皮细胞 (u2线) 转染增强黄色荧光蛋白融合到过氧化物的靶向性的多肽序列 (绿色荧光),和随后 immunofluorescently 用共轭对 Alexa 氟 568 (红色荧光) 针对过氧化物酶体膜蛋白 (PMP-70) 的二次抗体标记中呈现的数字 6 (a) 和混乱。图 6 (a) 中的图像的黑色水平设置为太高,从而导致降低强度为黄色荧光蛋白标签。这种错误扭曲共定位分析产生的重叠像素从绿色通道人工低可探测的水平。适当层次分明的图像所示图混乱,演示显著更高程度的定位。

在恒河猴肾上皮细胞 (LLC MK2线) 的线粒体网络共同转染增强的黄 (EYFP) 与HcRed1荧光蛋白载体靶向线粒体的肽序列。在成像,过程中多亮 EYFP 急剧黯然失色的荧光信号从 HcRed1,这是弱几乎 100 倍,当探测器渠道有类似电压、 增益和偏移量的设置 (图 6(b))。调整中 HcRed1 探测器来平衡的荧光蛋白荧光光谱强度的通道值克服了这种差异,揭示了大量的定位 (图 6(e))。请注意在调整后的图像相比,支配与紧密匹配通道捕获的图像的绿色色调荧光的黄色外观。

错误登记的重叠的频道所示图划定为 · 塔赫尔卵巢细胞 (HJ1。Ov线) 沾满 Alexa 氟 488 共轭对鬼笔 (绿色丝状肌动蛋白) 和 Alexa 氟 568 二次抗体靶向抗粘着斑蛋白鼠标 (焦粘连)。肌动蛋白丝两端应肿瘤与纽蛋白在此标本,但他们的不稍有注册的图件,是用在图像的右下角的红色和绿色荧光标记微球。发布采集图像处理要对齐的渠道 (图 6(f)) 共定位分析还原图像配准 (和微球的) 产生优秀的候选人。

结论

之间在进行调查的荧光基团时要考虑的最重要的点定位是确保标本贴标的尽可能高的质量。应该分析和选择的特异性、 低的背景下和缺乏交叉反应性抗体和合成荧光团。为了减少流血,通过工件,荧光探针组合与广泛分离发射谱是最适合用于定位实验。适当的控制,包括标本用标记每个探头单以及污泥而不染的自体荧光标准,应编写和流血,通过在实际的实验条件下的审议。一旦试样参数进行了优化,可以解决仪器和软件方面的考虑。它是重要的是记住可怜的试样的制备通常不能由数字图像处理技术克服。在大多数情况下,贴标条件的完善将节省大量的时间和最终产量优越的结果。

谈到的仪器配置要求,最高质量的复消色差显微镜物镜是减少色差,会消极地影响定量定位计算所需。许多制造商已经介绍了计划复消色差的物镜在整个可见的光的波长区域 (400-700 纳米),大大有益于定量荧光显微镜调查矫正色差。荧光发射的所有筛选器应具有与荧光谱线轮廓匹配的带通传输特性进行优化。这是一个最重要的考虑因素,控制流血,通过从其他荧光试样中。如果流血,通过检测到控件 (单探头和自体荧光) 中,顺序扫描的标本用显微镜配备声光可调谐滤光器 (AOTF) 为 multitracking 将产生最佳的结果。在某些情况下,流血,通过软件校正可能有必要在进行定位分析之前。