设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

徕卡显微镜激光观察神经纤维植物细胞

2014-06-26  发布者:admin 

 植物次生代谢产物参与各种植物生理生化过程,从而使植物要成功地与他们的生物和非生物环境互动。这些化合物在组织和细胞水平的分布格局表明植物防御系统如何组织的有针对性和精确的方式管理环境的挑战。在这里我们目前我们的出版物使用激光显微切割 (LMD) 来分隔不同的植物细胞类型的概述。

徕卡 LMD6000 和徕卡 LMD7000 的激光显微切割系统被用于解剖的特定单元格、 单元格人口和微观组织块不同的植物,如Dilatris物种 (Haemodoraceae) ,挪威云杉 (松科云杉冷杉金丝桃属植物物种 (Hypericaceae),油菜十字花科植物甘蓝型油菜L.), Colquhounia 黑老虎变种翅果油树(唇形)和大麻(次生) 。LMD 程序,LMD (A),(B)、 激光显微切割技术术后样品处理 (C) 和 (D) 有针对性的植物次生代谢产物的分析样品制备的一般工作流程是所示,讨论了为每个样品 (表 1)。介绍了相同或类似的方法在只有一次详细介绍

表 1: LMD 过程的工作流。

一步

 

A

样品的制备

B

激光显微切割技术

C

术后样品处理

D

植物次生代谢物的测定

作为一种工具 LMD 收获从分泌腔Dilatris pillansii巴克, Dilatris 铜锤Berg 的树叶。Dilatris 桑子L.

从新鲜的Dilatris组织分泌腔

Haemodoraceae、 Strelitziaceae、 科类、 芭蕉科植物家庭共同有次生代谢产物,称为 phenylphenalenones一组。Dilatris是 phenylphenalenones 的唯一已知拥有内部分泌腔 (SC),其略带红色的颜色建议在场的 Haemodoraceae 家庭的成员。使用研磨方法浅表 SC 提取盾状腺毛的唇形的一些成员已成功;不过准确地从周围的组织,从而使它们的内容的植物化学成分分析分离 SC 的内部供应链的外科解剖带来新的挑战

(A) 在第一种方法,新鲜的叶子, d。pillansii被切成小块,然后被嵌在组织冻结媒体和液态氮冷冻的管理单元。作为有机溶剂的化学脱水植物组织中的石蜡包埋的过程,和使用这可以损害 LMD 样品完全失去了 SC 的橙色彩色内容的结果,超低温 (在摄氏-25 º C) 被认为更适当为 LMD 准备组织样本。冷冻的叶碎片是用切片机切和被安置在一张幻灯片上。

(B) 厚度的 60 µ m 被证明是最好的解剖腺上皮细胞的 SC 和其分泌的存储空间。在一个单一的运行的激光很多时候实现这一点。只有少数几例观察泄漏和这些 SC 因此而被丢弃。高粘度的植物化学成分含量的 SC 固定,后者到玻璃幻灯片。25 孤立的 SC 因此被锋利的解剖针体视显微镜下的玻璃幻灯片从挑选。

(C) 术后样本治疗包括提取丙酮: 水 (20: 1) 与次生代谢产物的混合物和去除细胞碎片用离心机。上清液直接转移到新鲜的微细管,在氮气下晒干。

(D)残留进行了再在氘代溶剂中溶解和分析反相液相色谱法和低温1H 核磁共振 (NMR) 技术。比较确定了两个主要和次要的 phenylphenalenone1H 核磁共振谱和 LMD 样品的高效液相色谱-与参考化合物。检测到 phenylphenalenones 的相对比例积分的比例所选择确定1H NMR 信号。糖苷 phenylphenalenones 没有建议 SC 是亲脂性的隔间。

Dilatris 植物标本室组织分泌腔

我们开发了一种新的方法来解剖 180 岁 SC 的叶子和内、 外花被片在标本 (专为D.桑子D.铜锤标本)。作为从D.反对在新鲜叶片的材料的供应链pillansii、 植物标本室材料的 SC 未涵盖的周围异构细胞从所有两侧

(A) A 专门制造金属框架结合允许修复 SC 位于整个样品的薄玻璃片。

(B) 二十 SC 收获了使用 LMD。

(C) 观察神经纤维材料的收集使用重力微管的盖子,然后直接转给了核磁共振管不离心。

(D) 增加了 Deuterated 溶剂和混合了造影 1 分钟。采用低温提取的植物代谢物测定1H 核磁共振波谱法。一个 phenylphenalenone 被确定比较1H 核磁共振谱与那些正宗的参考。Phenylphenalenone 在 SC 的这两个新鲜植物材料和超过 180 岁标本的检测证明了这种植物次生代谢物的长期稳定性。

LMD 作为一种工具来探索挪威云杉(欧洲云杉)树皮的植物化学组分

石细胞

挪威云杉(欧洲云杉)是最丰富的针叶树物种在欧亚大陆的北方和温带森林。这种生态和经济的重要康年综合数组的化学防御化合物,如松脂、 单声道、 倍半和二萜类化合物和多元酚类物质,作为植物次生代谢产物参与防御病原体和草食动物包括苯乙烯、 苯丙素类、 黄酮类化合物的粘性混合物。很多的出版物处理过的防卫作用的松脂少也,以解决多酚,这是由 Schiebe et al. 调查的焦点的作用。LMD 和低温核磁共振波谱法的组合被用于石细胞 (石细胞) 挪威云杉树皮 (图 1) 中的微量化学分析。两种酚类化合物,二苯乙烯 astringin 和黄烷酮醇 dihydroxyquercetin 3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷被确定的核磁共振谱的提取与那些引用和 MS 数据的比较.

(A)树皮块取样从不同高度 (5 米、 15 米和 20 米) 的树木在室外生长。一个新鲜的剃须刀片用于切割材料纵向在离地面 1.5 米的高度。冰冷却带被运送到实验室和嵌入在组织冰冻介质和立即用液态氮冷冻,然后保持在-20 ° c。碎片然后在-20 ° C 到 30 毫米厚片 cryosectioned,安装在标准的显微镜载玻片,朝下节把它们放在一个徕卡 AS LMD 系统上。

(B)石细胞能从周围的韧皮部细胞荧光模式排放 515 nm dicroic 镜子 510 nm 励磁 450 — — 490 nm) 的区别。激光观察神经纤维材料收集中的微量离心管帽的重力。两到三天有必要,每个样本的消费税。多余冷冻介质存在排除在外的石细胞向边缘部分的集合。后 2 h 的收集,微细管已从 LMD 系统,避免过度变暖的采集的植物材料通过显微镜灯。

(C)离心法微圆管内允许使用的材料在容器的底部上定居。在含硅凝胶在黑暗中在 4 º C 48 小时的薄层色谱法储罐进行了物料的干燥。温和条件提供彻底干燥,并最小化残差 HDO 信号中的核磁共振谱。

(D)提取被执行在核磁共振管中,向其中添加的植物材料和氘代的甲醇和紧接其后的造影为 5 分钟1H-NMR,1H-1H 舒适和 HSQC 谱录得两种酚类化合物的测定 (astringin 和 dihydroxyquercetin 3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,如上文所述)。芦丁是作为一种内部的标准用于定量使用的两种酚类化合物的分析1H 核磁共振。

图 1: 流程图突出联合的激光显微切割技术 (LMD)/NMR/MS 议定书 (修改后) 的关键步骤。施普林格科学 + 商业媒体的善良许可: 李 S-H 施耐德 B Gershenzon j: 微量化学分析、 激光观察神经纤维石细胞的低温核磁共振波谱的挪威云杉。Planta 225 (3): 771 — — 79 (2007 年) ;doi: 10.1007/s00425-006-0376年-z。

 

韧皮部薄壁细胞

虽然成熟挪威云杉树木经常被杀害,由树皮甲虫齿小蠹和其相关联的蓝染真菌,长喙壳 polonica,某些基因型的这针叶树是更耐树皮甲虫或其真菌比其他关联。专门的韧皮部细胞的挪威云杉树皮的膨胀和改变他们植物化学成分的含量,对攻击的树皮甲虫和其微生物副教授。结合 LMD1H NMR 被用来比较正常的韧皮部薄壁细胞和韧皮部薄壁细胞感染C.polonica从挪威云杉 (图 2) 的干树皮的植物化学成分含量.

(A)树皮块从正常控制和受感染的韧皮部薄壁细胞从同一棵树上被收集和存储在使用前 –80 º C。样品被嵌入在组织冻存培养基,管理单元冷冻在液氮和 cryosectioned 成 40 µ m 厚片。

(B)激光显微切割技术是徕卡 LMD6000 系统上执行。C.polonica-感染样品,感染细胞本身不被收集,但细胞的感染网站旁边被选为分析。两个健康层的韧皮部薄壁细胞间的细胞层作为源用于筛胞。耗时集合所需的每个样本的 3 — — 5 h。每个管的植物材料的收集时间只限于 1 — — 2 h,以避免样品材料升温。

(C)无形的肉眼,样品被不干燥和直接用氘代甲醇提取和转移到核磁共振管。

(D) 1H-NMR 谱提取的立即记录并与酚醛引用比较。二苯乙烯苷 astringin 被证明是位于韧皮部薄壁细胞的主要次生代谢产物,在相邻筛细胞显著较低的浓度。黄酮 (+)-儿茶素在韧皮部薄壁细胞后出现感染的C.polonica,虽然减少了 astringin 的水平,相比,在非感染细胞。

图 2: 激光显微切割技术 (LMD) 多酚类薄壁组织和筛细胞从挪威云杉树皮的部分。显微照片显示节之前和之后 LMD (规模酒吧: 50 毫米),和在集合帽切 (规模酒吧: 200 毫米)。R = 射线薄壁细胞,S = 筛胞,PP = 多酚薄壁细胞 (修改后)。转载许可李 S-H et al.从: 挪威云杉(欧洲云杉)韧皮部薄壁细胞中酚类化合物的本地化。ChemBioChem 13: 2707年 — — 13 (2012 年)。版权所有 © 2012年威里 VCH 出版社 GmbH & Weinheim 有限公司 KGaA。

 

LMD 作为一种工具,调查中黑暗和半透明腺金丝桃属植物物种的代谢配置文件

贯叶连翘,通常称为圣约翰草是全球畅销的药用植物之一。轻度到中度的抑郁可以有效治疗,与对照临床试验证明这种植物地上部分的筹备工作。黄酮类化合物、 呫吨酮、 生物类黄酮、 等其它尤其是异戊烯基 phloroglucinols 贯叶金丝桃素和 adhyperforin 等都是由属金丝桃属植物的 Hypericaceae 的成员产生的主要植物次生代谢产物植物家庭。这些化合物都被本地化的多细胞,球状或隧道状聚合等分泌道和黑暗和半透明的腺体。我们选择了现代技术的结合: LMD 和矩阵无紫外激光解吸电离 — — 大规模光谱成像 (LDI MSI) 和经典的方法: 提取的整株植物材料使用的有机溶剂,来隔离并识别高度本地化的 UV 吸收化合物.

(A)以消费税的黑暗和半透明的腺体,萼片和花瓣的H.贯叶连翘H.reflexum,从这些固定之间薄玻璃片和一个特制的金属框架 — — 习惯关长 SC Dilatris属,如上文所述的过程类似。

(B)从花瓣深色的腺体和从黑暗和半透明腺体的夹层叶进行氮固态激光器的徕卡 LMD6000 系统。

(C)收集的腺体简要离心和甲醇被加入到微圆管内。

(D)后短暂的超声波,整除数的个别样品溶液被转移到 MALDI 板和干果上他们 LDI-质谱调查。没有矩阵的电离是必要的可能是因为较强的紫外吸收植物次生代谢物的。激光微解剖深色的腺体的花瓣,黑色结节和树叶的半透明腺体的 LDI-质谱分析揭示了存在的不同植物化学成分的简介等其它、 黄酮类化合物及 phloroglucinols 在不同本地化的腺体。

LMD 作为一种工具来研究防御次生代谢产物在盾状腺毛的Colquhounia 黑老虎变种翅果油树

东南亚国家属Colquhounia从唇形植物家庭是一个 colquhounoids A — — C,一类新的 C 的一个特殊群体的来源25萜类化合物,含有。叶、 芽和这种植物的茎是由一层致密的众多无腺毛状体和盾形和头状腺毛状体覆盖。LMD 和 ultraperformance 液相色谱/串联质谱 (UPLC/MS) 的组合被用于分析的盾状腺毛状体 (图 3) 的植物配置文件.

图 3: 分析平台的单个细胞水平定在中国科学院昆明植物研究所植物次生代谢物。

 

(A)C.黑老虎变种翅果油树刚收割的叶子被固定到一个特制的金属框架上。

(B)装入幻灯片上徕卡 LMD7000 系统具腺毛状体后观察神经纤维,在一个微圆管内收集了 500 人。

(C) 3,000 g,4 º C 3 分) 的短暂离心沉到了水底管的腺毛。提取方法,增加了丙酮和小瓶造影在 4 º C 的 10 分钟。

(D)与 UPLC/MS 分析然后了上清液。三个主要的化合物: colquhounoids A — — C,也有从整个叶片材料从C.黑老虎变种翅果油树和毫不含糊地确定的核磁共振和 x 射线衍射的甲醇提取物中分离,被发现在总离子色谱保留与时代 25.4、 28.9 和 23.7 min 和积极 ESI 质谱与分子量的 430 中、 432、 448,分别 (图 4)。

图 4: C黑老虎变种翅果油树植物在绽放,(B 和 C) 的盾形和头状腺毛在叶背面上,盾状腺毛与激光显微切割技术,观察神经纤维盾状腺毛与 UPLC/MS/MS (修改后) 中次生代谢产物 (G — — J) 微型化学分析 (D — — F) 集合。转载从组织架构 Lett 许可。15: 1694年 — — 98 (2013 年)。版权所有 2013年美国化学学会。

 

LMD 作为一种工具,揭示不同油菜 (甘蓝型油菜L.) 组织中次生代谢产物的分布模式

油菜(甘蓝型油菜)是种植用于生产生物柴油、 动物饲料和植物油用于人类消费。由这个主要产油作物提供的全球石油生产的重要组成部分 (15%)。脂类的主要存储站点是种子的胚。主要次生代谢物的甘蓝型油菜种子是硫代葡萄糖甙和酚胆碱酯类。虽然这些次生代谢产物有腥味属性,但他们是非常重要的生态价值的生物和非生物的相互作用的油菜[LMD 应用四个组织的各部分 (下胚轴和胚根、 子叶内在、 外在子叶和种皮和胚乳) 的甘蓝型油菜种子从彼此使用 LMD

(A)成熟种子的甘蓝型油菜垂直嵌入在组织冻存培养基,立即冻结在液态氮和 cryosectioned 成 60 µ m 厚片在使用冷冻切片的 –24 º C。

(B)节直接登上了对膜帧幻灯片和解剖使用徕卡 LMD6000 激光显微切割系统。四个不同的组织部分先后解剖使用最强的激光强度和移动速度最慢的激光。材料的四个解剖组个别微细圆管内收集了包括支持膜,被切割和收获与植物材料的重力。

(C)观察神经纤维材料被然后转移到高效液相色谱法小瓶和 1 毫升 80%(v/v) 甲醇被加入另外提取次生代谢产物在超声波浴为 10 分钟,白芥子苷 (10 µ M) 和肉桂酸胆碱酯类 (10 µ M) 被添加到内部标准、 硫代葡萄糖苷,白芥子苷和肉桂酸胆碱酯类为芥子碱萃取液。硫代葡萄糖苷分离后从使用阴离子交换固相墨盒的其他化合物。

(D)非硫甙化合物的分析由 LC-女士 LC-爸爸/MS 用来分析芥子油苷在他们脱硫的形式通过与那些引用 MS 数据和保留时间的比较。结果表明硫代葡萄糖苷油菜成熟胚组织中均匀分布。均匀分布的芥子碱作为主导酚醛复合在油菜胚胎组织支持其仓库功能。另外非硫代葡萄糖苷组分化合物如循环亚精胺复合物仅见于下胚轴和胚根和两个黄酮类化合物主要是在子叶中找到。

LMD 作为一种工具,消费税的大麻大麻素分析的毛状体

大麻是一种年度雌雄异株植物。它起源于东欧和中亚地区长期以来一直作为一个来源为传统医学栽培。负责C.苜蓿的生物活性化合物似乎是 phytocannabinoids,一个独特的 terpenophenolics 拥有 alkylresorcinol 和单萜烯基群体。大麻素和精油生产的主要景点是毛状体,特别是头状柄的腺毛。次生代谢产物生产大多是在最后五周的八个星期的总的开花周期期间。因此从周 7:56 上午在开花期的腺毛,由 LMD 收获和大麻素配置文件由 LCMS 和低温核磁共振法进行分析。

(A)的苞片和花被切成小片 (长度 0.2 — 0.5 厘米) 和固定在 4%磷酸缓冲甲醛,暴露 10 分钟真空,一夜之间渗透在-4 ° C,然后安装与钢框架 (PET 膜,25 毫米 × 76 毫米) 幻灯片上的碎片.

(B)完好使用徕卡 LMD6000 显微镜解剖柄的头状的毛,元首和茎,以及作为完整的头状无梗毛。从每个样本,25 — — 143 毛状体被切除并收集的重力在离心管中。观察神经纤维材料当时 vortexed 为 1 分钟,离心离心 5 min。为了避免脱羧基作用和退化的大麻素,解剖的样本被存放在-20 ° C LMD 之后直接.

(C)为液相色谱-质谱分析,60 µ L 甲醇被添加到每个观察神经纤维样品从 4、 5、 6、 7、 和 8 个星期、 造影 10 分钟和一夜之间在室温下孵育。样品,然后被稀释在 H2O/甲醇 (2/1,v/v) + 0.1%甲酸溶液。对于低温核磁共振测量,最低限度的氘代氯仿被添加到在 8 周收获的解剖头状柄和头状无梗毛状体。后发音为 1 分钟,溶液转移到核磁共振管的分析。

(D)液相色谱-质谱和核磁共振数据确定 Δ9-tetrahydrocannabinolic 酸 (THCA) 和醇酸赵虹作为头状柄和头状无梗毛状体的主要的化合物。液相色谱-质谱分析数据被用于的大麻素配置文件观察神经纤维毛状体收集过去 5 周的生长周期的比较研究。结果表明: 质的相似性的调查样本。THCA,业内,cannabigerolic 酸 (CBGA) Δ9-四氢大麻酚,cannabidiol 和 cannbigerol 被确定在所有样品中开花阶段。Cannabichromene 和大麻酚检测作为次要化合物仅在完整柄的头状毛状体的样品和他们的头在 8 周收获。

结论

目前我们的基于 LMD 的出版物概要显示广阔的多样性的植物材料,可以准备获得本地化的植物化学信息在细胞水平 (叶、 茎、 花和种子材料的不同物种从不同植物的家庭)。基于 LMD 的化学分析可以揭示不均匀和植物发育阶段依赖特殊组织中次生代谢产物的积累。因此程序可用于确定不同的、 依赖于器官的生物功能的次生代谢产物。此外有关代谢产物的特定的本地化信息可能有用来研究生物合成途径、 代谢产物的改性和其浓度的调节。不同植物材料制备方法为 LMD 的如样品材料专门制造的幻灯片系统中直接使用或嵌入的样品材料之前给出了材料的透射。然而,我们是样品的意识到挑战制订修改的或新的分析战略,为每个新的制备。进一步改进领域的分析方法可以最小化成功识别所需的资料。因此可以允许这些难隔离材料样品的研究减少工作负荷来分析这类组织和化合物。

 

鸣谢

我们感谢亚历山德拉 zum Felde 编辑的帮助。作者非常感谢 Daniel Veit LMD 为构建特殊的幻灯片。