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奥林巴斯显微镜激光扫描共聚焦进行活细胞成像的技巧探讨

2014-06-03  发布者:admin 

 近年来随着生物实验技术的不断发展,活细胞显微成像实验变得越来越重要。细胞中很多重要生命活动的研究,如细胞的分裂、分化,细胞迁移,蛋白质的运输等过程,都必需通过用显微镜进行活细胞成像才可以观察并记录到。对于显微成像来说,激光扫描共聚焦显微镜(以下简称confocal)是获得高分辨率特别是高的z轴分辨率图像的利器。这与confocal 的设计原理相关,confocal的光路中设置了针孔(pinhole),能够挡住来自于标本非焦平面的杂散光,因此可以获得薄的光学切片,极大地提高了z轴的分辨率。随着confocal的普及,用confocal进行活细胞成像的需求越来越多。但是由于confocal仪器自身的特点,以及活细胞对生长环境的苛刻要求,如何用confocal进行活细胞成像需要很多的技巧,而且对confocal的性能要求也特别高。下面我们就用confocal进行活细胞成像遇到的问题以及技巧进行探讨。

一、保证细胞正常的生长环境
在用confocal进行活细胞延时成像时,焦平面的漂移问题一直是困扰广大科研工作者的问题之一。活细胞延时实验往往需要在confocal上放置活细胞培养装置,如图所示,必需保证细胞处于一个合适的生长环境,能够进行正常的生长代谢。这个活细胞培养装置需要温度保持在37℃,通入5%浓度的CO2气体,并加水保证湿度达到100%。当成像时间较长时,高倍物镜也需套上一个加温装置,给物镜加温。

二、如何克服用confocal进行活细胞延时成像中的焦平面漂移问题。
产生焦平面漂移的主要原因在于利用高倍物镜成像时,由于需要以水或者油为介质,因此热量会通过介质从物镜传递到培养皿中,延时成像过程中,显微镜金属机身的热胀冷缩使焦平面发生漂移。由于高倍物镜成像的焦深比较短,对于焦平面的漂移容忍度很低,因此在采集图像过程中,我们会发现荧光图像越来越弱,越来越不清晰,直至无法采集到任何荧光图像。

为了克服这个问题,我们往往在利用confocal进行活细胞延时成像时,必需用到焦点零漂移补偿系统(Zero Drift Compensator, 简称ZDC)。ZDC的工作原理是以一束789nm的远红外激光探测培养皿与介质之间的反射面,从而利用offset值纠正焦平面的漂移,使采集到的图像始终处于在焦状态。以奥林巴斯新的激光扫描共聚焦显微镜FV1200为例,该款产品搭载了最新IX3-ZDC系统,不仅具有可以帮助用户快速找到标本焦平面的“一键式聚焦”的模式,还具有“连续锁焦”模式,很好的解决了用户在进行活细胞延时实验时,因加药而引起的焦平面漂移问题。保证了需要进行加药的测钙实验或者FRET实验结果的准确性。

此外,FV1200搭载的IX83显微镜机身采用了闭合结构及高刚性设计,极大地提高了系统的稳定性。配合IX3-ZDC极大降低了活细胞延时成像中的Z轴和XY轴方向的漂移问题。

三、如何克服用confocal进行活细胞延时成像中的标本荧光淬灭的问题。

标本荧光的淬灭俗称标本的漂白,是指标本因受到光照射而出现的荧光信号逐渐变弱甚至检测不到的现象。在用confocal进行活细胞延时成像时,主要有两方面的因素,会导致标本荧光淬灭。原因之一是在目镜下观察标本时,标本受到汞灯等的照射,可能会出现淬灭。第二个原因,也是最主要的原因在于,用confocal成像时,标本因受到激光的逐点照射扫描,更容易出现淬灭。针对这两个原因,首先,在制备标本时,应该加入放淬灭剂,防止标本荧光信号较快地淬灭。其次,用目镜观察标本时,需要尽可能缩短光照时间,降低激发光强度,注意使用电动shutter等。最后,在进行激光扫描成像时,应该尽量降低激光的光强度。仍以奥林巴斯FV1200为例,FV1200搭载的IX83显微镜,采用了大靶面新镀膜技术的激发块,对激发和发射光的透过率更高,可以用较弱的激发光,在目镜下观察到更亮的荧光信号。更为重要的是,FV1200的扫描振镜进行了革新,采用了全新的镀银技术,其反射效率高于传统的镀铝振镜的反射效率。特别是在780nm左右的波段,XY扫描振镜总的反射效率最大可以提高2倍,这样就可以尽可能用低的激光的强度来采集较亮的荧光信号。另外,FV1200上面可以配备高灵敏度制冷的磷砷化镓(GaAsP)检测器。这种检测器的优势是QE值比普通PMT要高,特别适合采集比较弱的荧光信号。QE值是指光信号转换为电信号的效率,QE值越高,光电转换效率越高。普通的多碱性PMT检测器QE值低于30%,而GaAsP检测器的QE值在450nm-600nm波段均达到45%左右。用同样的荧光标本进行对比测试,以同样强度的510nm激光扫描图像,其余条件不变,我们检测到的荧光信号的亮度可以提高30倍。GaAsP检测器具有低于室温10℃的制冷功能,可以使暗电流降低70%左右,采集到的图像更加明亮、信噪比更高。

综上所述,在用confocal进行活细胞延时成像的实验中,我们要注意使用活细胞培养装置,保证细胞正常的生长环境。此外,成像中使用ZDC防止焦平面漂移。尽量降低激发光强度避免标本荧光信号淬灭。只有满足了上述条件,才可能采集到比较好的荧光图像。