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徕卡显微镜从小肽的吸收建立和鉴定派生的瓣胃上皮细胞模型

2014-05-07  发布者:admin 

 

介绍

反刍动物的forestomach历来是上皮运输研究的建设性模型,该forestomach,特别是瓣胃(圣经),它在营养物从摄取的吸收中起重要作用,例如水,挥发性脂肪酸,矿物质,电解质氨基酸(AA)的和小肽。 有趣的是,相比于瘤胃,瓣胃具有更强的吸收能力小肽。

肽在动物营养的吸收和利用进行了详细审查别处。 肽包含在forestomach的可溶性非氨氮一个显著部分和总氨基酸在反刍动物的门户排水内脏。 此外,肽可通过乳腺对乳蛋白的合成被利用和由许多其他组织中的营养和功能活性 。 一些研究已经表明,AA的肽的形式的传输比AA中的每单位时间的游离形式更有效。 此外,据报道,一个大数量的二和三肽和各种模拟肽的药物是通过寡肽转运蛋白1(PEPT1,SLC15家族)中肠细胞的顶膜吸收进入胃肠道的上皮细胞。

然而,在小肽在反刍动物胃肠道中的吸收许多以前的研究已经在动物,组织模型或在细胞系中进行的。 然而,大多数这些细胞系已经失去了器官特异性功能,由于其分化状态。 此外,这些研究大多是短期的。 因此,建立基层上皮细胞反刍动物的forestomach孤立的一个长期的文化可能为它们的功能研究的一个更好的模型。 来自各种动物的瘤胃得到上皮细胞的原代培养之前已经描述,如绵羊、小母牛和母羊,虽然还没有研究报告长期培养和从奶牛和在这些细胞中的肽吸收的作用得到瓣胃上皮细胞(嗅鞘细胞)的表征。 瓣胃,这是复层鳞状组织,由四个上皮阶层,如瘤胃:角质层,颗粒层,棘层和基底层 然而,这是难以分离这些上皮细胞。 本研究成功地使用特定的胰蛋白酶的浓度和消化时间通过串行消化法分离这些细胞。 本研究的目的是:(1)建立和表征牛OEC文化和(2)由forestomach上皮细胞在体外用嗅鞘细胞的牛,研究小肽吸收的功能。

材料和方法

操守准则

这项研究是根据对实验动物福利(科技部中国科技,2006年)的国家指导方针和批准的机构动物护理和使用委员会在浙江大学进行。 在瓣胃组织是从阜阳屠宰场,杭州,中国获得和我们获准使用这些动物部分从这个屠宰场。

细胞培养和存储介质

在细胞生长培养基由Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM,Gibco公司,美国),补充有10%(V / V)胎牛血清(FBS)(Gibco公司,美国),5μg/ ml的胰岛素,10高葡萄糖制剂纳克/毫升的表皮生长因子(EGF,Sigma公司,美国),100 U / ml青霉素,100微克/毫升链霉素,50微克/毫升庆大霉素和2.5微克/毫升两性霉素B的新鲜制备的细胞存储培养基由70%(体积/体积)的DMEM,20%(体积/体积)FBS和10%(体积/体积)二甲基亚砜(Sigma公司,美国)。

分离培养嗅鞘细胞和

牛瓣胃组织被新生中国荷斯坦犊牛获得它们被宰杀后,立即,然后运到在冰冷的DMEM实验室。串行胰蛋白酶消化进行,以嗅鞘细胞分离如前所述。 简而言之,将组织洗涤数次,用冰冷的D-Hank氏(平衡盐溶液)含有500单位/毫升青霉素,500微克/毫升链霉素,100微克/毫升庆大霉素和5微克/毫升两性霉素B,直到溶液是干净任何污染物。 接下来,瓣胃上皮薄层是用手术刀为约1厘米2片切碎。 碎薄片(约20g,湿重)消化在一个250ml的锥形含有100ml 2.5%胰蛋白酶(Amresco公司,美国)在D-Hank氏在摇动温热空气1小时,溶液在37℃下的烧瓶浴。 接着,将消化溶液弃去,用新鲜​​溶液替换2或3次,以除去角质层上皮细胞。 当一团细胞具有均一的形态出现,角化细胞是不占优势,在消化溶液收获并用新鲜的溶液中,约每20至30分钟,这取决于消化状态所取代。 胰蛋白酶是细胞收获后终止,加入冰冷的D-Hank氏含有10%FBS到消化溶液(以1:1的比例,体积/体积)。 过滤与4层的1毫米的尼龙网孔后,将收获的溶液离心分离,在300×g离心 5分钟,在4℃下,以从颗粒除去任何残留的胰蛋白酶。 接着,将组织进一步消化7-8个周期。 使用血细胞计数器对细胞产量进行了评估和细胞存活率分别使用台盼蓝染色,估计。将细胞再悬浮于生长培养基中,然后接种5×10 4个细胞/ ml在塑料培养皿(康宁,美国)涂布有I型胶原(Gibco)中的密度。 培养皿在37℃和5%CO 2的加湿气氛和生长培养基根据生长条件改为每2或3天。

以纯化的上皮细胞,融合细胞分别为第一消化用10分钟,0.15%的胰蛋白酶溶液。 当分离的成纤维细胞,并没有变化,嗅鞘细胞进行观察,将细胞用D-Hank氏洗涤。 接着,将剩余的细胞用0.1%胰蛋​​白酶-0.02%EDTA消化5-10分钟,并接种到新的培养皿中(1:2)。 对冷冻保存,将细胞以1×10 6个细胞/ ml时,分配到冷冻管的密度重新悬浮在存储介质中,并储存在液氮中。

用于苏木精和伊红染色,将组织固定在4%甲醛溶液中。 24小时后,将组织包埋在石蜡中,切成5μm的切片并用H&E对用标准方法组织学检查。

嗅鞘细胞的生长特性

嗅鞘细胞的体外生长方式是由细胞的倍增时间确定。 采用WST-8(博士德,中国)检测细胞增殖情况。 简言之,嗅鞘细胞在96孔板(康宁,美国)一式四份接种5×10 3每孔的细胞。 在特定时间点,将10μl的WST-8溶液加入到每个孔中。 接着,将细胞温育于37℃下反应1小时,将吸光度在450nm的波长用酶标仪(Molecular Devices公司,美国)测定。 活细胞的数目是成比例的吸光度。 用相衬显微镜(Nikon ECLIPSE 50i的,东京,日本),将细胞的生长和形态进行了评估。

电子显微镜对嗅鞘细胞的超微结构

嗅鞘细胞用PBS洗涤两次,然后固定,用2.5%戊二醛在4℃下过夜。 将细胞用PBS漂洗两次,后缀,用1%四氧化锇为2小时。 在串行乙醇稀释脱水的细胞后,将细胞从它们的塑料支撑报废和嵌入的Spurr树脂。 超薄切片中依次沾上醋酸双氧铀和碱性柠檬酸铅,每次15分钟,并用透射电子显微镜(TEM,JEM-1230,JEOL)观察。

首先对扫描电子显微镜(SEM)制成OEC盖玻片。 根据标准程序用于TEM固定和脱水后,将试样涂覆有金 - 钯和使用SEM(飞利浦,XL30,荷兰)的观察。

免疫细胞化学染色

细胞角蛋白染色,将细胞接种于激光共聚焦培养皿(巢,中国),并洗涤3次,用D-Hank氏,用于在-20℃下10分钟,用甲醇固定和丙酮(体积/体积),并透化,用0.25 %PBS-的Triton 10分钟。 然后将细胞在PBS中含5%正常山羊血清阻断非特异性蛋白质 - 蛋白质相互作用进行孵育初级兔抗细胞角蛋白18抗体(稀释至1:50,Abcam公司,HK)和兔抗PEPT1抗体(稀释1:100,北京博奥森生物技术有限公司,中国)一夜之间在4°C。 随后,将细胞温育在次级FITC-偶联的山羊抗兔IgG抗体(稀释度1:100,杰克逊免疫研究实验室公司,美国),用DAPI(Sigma公司,美国)。 将细胞在室温下在黑暗中温育1小时,随后漂洗3次,用PBS进行5分钟,并用激光共聚焦显微镜(Leica公司,TCS SP5,德国)显影。

PEPT1 mRNA的嗅鞘细胞的测定

从牛瓣胃组织总RNA和嗅鞘细胞用冰冷的TRIzol(Invitrogen公司,美国)隔离。 RNA的完整性和纯度通过使用NanoDrop 2000分光光度计(热,USA)评估样品用1%琼脂糖凝胶电泳,并根据在λ260和λ280(> 1.8)的外径比被确认。 合成采用逆转录试剂盒(Takara,日本滋贺县)第一链cDNA。 (;产品长度正向:5'-TGGCTGGGGAAGTTCAAGAC-3'5'-TCCTGGCCCTCTTCAAA-3,反向':239碱基对)用反转录PCR使用以下特异性引物检测PEPT1(NM_001099378)的表达,以及甘油醛-6 -磷酸脱氢酶基因(GAPDH,AJ000039)担任内部控制(引物:正向5'-TTGTGATGGGCGTGAACC-3',反向5'-CCCTCCACGATGCCAAA-3';产品长度:198个基点)。 所用的PCR条件进行以下操作:在95℃下进行40个循环的5秒,34号,60℃和60秒,72℃下用30秒,在95℃初始变性和5分钟的最后延伸72°C。 扩增的PCR产物用2%琼脂糖凝胶,并用市售的测序公司(BGI,中国)测序。 的DNA序列进行比对来自国家生物技术信息中心数据库中的已知PETP1序列。

摄取甘氨酸-SAR成嗅鞘细胞

glycylsarcosine的摄取(GLY-SAR,模型二肽)的嗅鞘细胞是如前所述研究 。 Hank氏平衡盐溶液(HBSS:145 mM氯化钠,3 mM的氯化钾,1mM的氯化钙 ,0.5毫摩尔MgCl 2)含有5mM D-葡萄糖和5mM HEPES(pH6.5)中被用作吸收和冲洗介质。 嗅鞘细胞铺板在1×105个细胞/ cm 2在24孔板中的密度。 汇合(约3天)后,将细胞保持7天,以分化。 接着,用电子显微镜,这表明细胞已分化形成的微绒毛,桥粒和紧密连接下观察细胞。 在同一天,OEC单层细胞漂洗两次,预培养用HBSS 30分钟,在37℃下 摄取加入1 ml的培养液在不同pH下(5.0,5.5,6.5,7.5),并为特定时间段(2,5,10,15,30分钟)启动。 研究了浓度的甘氨酸基-Sar摄取依赖,细胞与不同甘氨酸-SAR的浓度(0.5,1.0,1.5,2.5,5.0毫摩尔),在37℃或4℃。 用于抑制研究中,将细胞在37℃孵育不同的蛋氨酸 - 甘氨酸(甲硫氨酸 - 甘氨酸)的浓度(0,0.5,2.5,5.0毫摩尔)在一式四份 所有孵育均在37℃进行15分钟,在用2.5mM的甘氨酸基-Sar pH为6.5,除非另有说明。 在孵育结束时,甘氨酸基-Sar溶液吸出,并将细胞快速洗涤四次,用冰冷的漂洗培养基(pH6.5)中。

以确定甘氨酸基-Sar的摄取量,裂解细胞用0.3毫升1%的Triton X-100溶液。 细胞裂解产物中的一部分离心12000×g的10分钟,并使用利用高效液相色谱法(HPLC,安捷伦,1100,美国),如下所述进行量化甘氨酸基-Sar。 裂解液的另一部分被用于使用BCA蛋白测定试剂盒(凯基生物科技,南京,中国)蛋白质测定。 GLY-SAR的摄取换算为nmol /毫克protein/15分钟。

HPLC条件:流动相:缓冲液A(0.1%三氟乙酸的水)和B(0.1%三氟乙酸的乙腈溶液)的混合物。 梯度洗脱,运行在10分钟内,从10%缓冲液B为原料,以50%缓冲液B,以1.0毫升/分钟的流速。 采用Kromasil 100-5C 18(4.6毫米×250毫米;阿克苏诺贝尔公司,瑞典)用作分析柱。 将样品的等分试样(10微升)注入HPLC系统和甘氨酸基-Sar是在220nm处进行检测。

统计分析

经方差分析和邓肯的使用SAS软件(SAS研究所,2000年)复极差测验进行统计分析。 该数据被表示为平均值±标准误差。 的标准意义成立为P <0.05。

结果

嗅鞘细胞的建立及生长特性

消化,用2.5%胰蛋白酶为1〜1.5小时后,角质层除去。 约5小时后,大部分的上皮细胞被成功地从组织中分离出不含细胞的子层的污染( 图1 )。 使用染料排除可行性的研究表明,90%的分离的细胞是存活的( 图2-A )。 分离的细胞粘附于塑料基体的壁培养(12小时后, 图2-B )。随后,嗅鞘细胞开始增殖并经过2〜7天在培养物(图2-C形成簇之前到达汇合)( 图2-D )。 成纤维细胞混合嗅鞘细胞的原代培养。 消化用0.15%胰蛋白酶后,首先从烧瓶壁,其余的嗅鞘细胞分离的成纤维细胞用0.1%胰蛋​​白酶-0.02%EDTA溶液,然后被释放。 纯化后,嗅鞘细胞显示均相“鹅卵石”上皮细胞样形态与几个可见的成纤维细胞。 此外,有2-4个核仁中的每个OEC和纯化的细胞显示出与在该塑料基体紧密连接的模式(一个清晰的边界图2-E )。 冷冻和解冻后,90%的嗅鞘细胞是存活的,并表现出正常上皮形态。 细胞单层形成后数天,cuticularized细胞出现上面的嗅鞘细胞( 图3-A,B )和单层证明圆顶形结构( 图3-C,D )。

缩略图
 


图1,苏木精和曙红(H&E)染色的瓣胃墙。

答:胰蛋白酶处理前瓣胃内壁具有完整上皮层(箭头)。 箭头表示上皮地层。 B:在瓣胃墙面无胰蛋白酶处理后上皮阶层。 条形代表100微米。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g001
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 2,孤立的瓣胃上皮细胞 形态在不同生长时期。

答:酶消化后,新生犊牛获得的(×200)上皮细胞悬液; B:大多数坚持以塑料基质与少量成纤维细胞的壁培养12小时后(×200)的瓣胃上皮细胞; C:2 d后培养(×100)细胞簇观察; D:在文化形成融合单层后大约一个星期(×100); E:净化文化显示的鹅卵石样形态(×100); F:梭形,成纤维细胞样细胞(×100)的融合单层; 成纤维细胞样细胞,用箭头表示。DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g002

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图3,嗅鞘细胞的融合单层的 开发形态。

答:Cuticularized细胞融合后的阶段嗅鞘细胞起源(×200); B:相衬的重点放在提高cuticularized细胞(×200)的顶部设置图像; 箭头表示典型cuticularized细胞。C(×100)和D(×200):细胞的募集层上方的塑料基体的圆顶结构(箭头)。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g003

嗅鞘细胞的生长图案绘制于图4中 。的2天的初始延迟后,细胞进入对数生长期(2-5天),然后将细胞生长缓慢,达到平台期。 嗅鞘细胞表现出了稳定的成长能力,人口倍增62 h的时间( 图4)。

缩略图
 


嗅鞘细胞的培养中图4。 生长曲线。

对数期开始的滞后相位的2天之后,用一个尖锐的倾斜和进入对数增殖期的第5天的细胞。N = 4。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g004

嗅鞘细胞的超微结构

形成后嗅鞘细胞的单层在7天中文化,用透射电子显微镜和扫描电镜(观察嗅鞘细胞单分子膜的超微结构图5 )。 极化单层观察根尖的微绒毛和对塑料基材一个基底层。 微绒毛是管腔肠上皮细胞的特征。 此外,桥粒,张力原纤维,紧密连接和基底膜内陷的融合细胞单层的相邻小区之间可以观察到。 这种类型的OEC单层在下面描述的传输研究中使用。

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图5,透射电子显微镜(TEM,A和B)和嗅鞘细胞单层的扫描电子显微镜(SEM,C和D)。

 

答:偏光单层成立,根尖微绒毛(MV)和在塑料基质上一基底层; B:通过桥粒(德),紧密连接(TJ)和基底膜内陷相邻细胞之间的连接(*)也清晰可见。 张力原纤维(T)还观察到在嗅鞘细胞。 C和D:SEM观察揭示了OEC单层的表面上大量的微绒毛样结构。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g005

细胞骨架18和PEPT1的表达

嗅鞘细胞进行染色以检查细胞骨架18,中间丝蛋白和上皮细胞的标记物的表达。 该细胞表现出很强的免疫阳性染色细胞骨架18( 图6 -A)。 PEPT1抗原表达检测免疫细胞化学在细胞质和嗅鞘细胞的细胞核( 图6 -B)。 只用第二抗体的阴性对照没有发现在细胞特异性染色(图6 -C)。

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图6。嗅鞘细胞的 免疫荧光染色。

嗅鞘细胞的染色细胞角蛋白18(A),PEPT1使用二次抗体只(C)(B)和阴性对照荧光图像。 细胞核用DAPI染色。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g006

PEPT1 mRNA的表达在两种上皮组织和上皮细胞( 图7 )。 扩增的PCR产物的测序显示100%匹配,以在GenBank中,其还揭示了分离的细胞的上皮起源和建议,这些细胞可以用于研究PEPT1的传输性质已知的牛线粒体DNA序列。

缩略图
 


图7, 在逆向瓣胃上皮组织和嗅鞘细胞PEPT1基因表达的转录PCR检测。

道L:100 bp的DNA梯状条带; 泳道1:瓣胃上皮组织; 泳道2:嗅鞘细胞; 泳道3和4:装载组织的持家基因甘油醛-3 - 磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达控制(3)和瓣胃上皮细胞中(4)。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g007

pH值和时间对GLY-SAR吸收由嗅鞘细胞的影响

分离的嗅鞘细胞表现出的甘氨酸基-Sar二肽一个显著摄取( 图8 )和摄取受细胞外pH值。 摄取也显著更高,在pH 5.5和6.5相比,在pH 5.0和7.5(P <0.05, 图8-A ),这表明在运输过程是pH依赖性。 因此,6.5的细胞外pH值被用于后续的实验。 培养GLY-SAR的摄取的最佳时间也是在嗅鞘细胞(确定图8-B )。 GLY-SAR通过嗅鞘细胞的摄取增加,培养时间增加,达到了5至15分钟之间的高原。 因此,在随后的所有实验中,孵育时间为吸收量为15分钟,以确保转运饱和。

缩略图
 


图8 pH值和时间对GLY-SAR摄取嗅鞘细胞的影响。

答:吸收GLY-SAR在不同pH为15分钟。 B:甘氨酸基-Sar的在不同时间点(分钟),在pH 6.5的摄取。 N = 4。重视与不同的字母(A,B)表示显著差异(P <0.05)。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g008

底物浓度,温度和GLY-SAR吸收竞争性抑制剂通过嗅鞘细胞的影响

还审议了嗅鞘细胞在温度和GLY-SAR浓度的GLY-SAR的吸收的作用。 GLY-SAR的摄取量显著高于37℃相比,4°C(P <0.05)。 此外,吸收在4℃下呈正比,甘氨酸-SAR的浓度和线性增加未经高原( 图9-A )。 温度对吸收的影响是通过PEPT1而不是被动的路由。 此外,通过PEPT1活性摄取估计在4℃下的总摄取,在37℃和被动的摄取之间的差。 即使在低底物浓度下(<2.5毫米)的介质中,吸收在37℃,明显高于比较至4℃,表明转运介导的过程提供更多的吸收的低浓度。 此外,转运介导的摄取饱和,2.5毫米GLY-SAR在介质中。 当GLY-SAR的浓度大于2.5毫米,吸收在37℃相似,在4°C。 此外,2.5mM的甘氨酸基-Sar用于随后的竞争抑制实验,其中的Met-甘氨酸抑制甘氨酸基-Sar的摄取( 图9-B )。 总之,这些结果表明,同一载体蛋白转运既GLY-SAR和Met-甘氨酸。

缩略图
 

图9,底物浓度,温度和甘氨酸基-Sar摄取嗅鞘细胞的竞争性抑制剂的作用。

答:嗅鞘细胞单层培养与不同浓度的GLY-SAR(0-5毫米),37℃(⧫)或4°C(▴)。 通过PEPT1活性(▪)摄取根据之间37℃和4℃的差,估计 B:0.5mM的甘氨酸基-Sar摄取测定蛋氨酸 - 甘氨酸(0-5毫米)的浓度的增加的不存在或存在。 甘氨酸基-Sar的在不存在抑制剂的二肽的测定摄取被设置为100%。 N = 4。

DOI:10.1371/journal.pone.0088993.g009

讨论

嗅鞘细胞的建立与表征

早在新生儿年龄的增长,反刍瓣胃的上皮细胞显示具有完整功能的完整形态结构。 在这项研究中,我们成功开发根据前述方法用于隔离瘤胃上皮细胞的方法,从初生犊牛隔离嗅鞘细胞。 形态学检查和PEPT1 mRNA和未接受抗蠕变饮食初生牛犊的瓣胃上皮蛋白表达证实,初生犊牛在结构和功能上配备吸收小肽与成人相似。 我们也试图从成年奶牛隔离嗅鞘细胞,但遗憾的是都没有成功,因为该细胞高度分化,难以纯化,增殖和传代培养。 因为小腿嗅鞘细胞的快速自我更新率,细胞有较高的增殖率较成人嗅鞘细胞。 此外,它是很容易获得的新生小牛清洁组织,因为它们的胃肠道不沾染饲料和微生物。

角质层,它主要包括死细胞,作为一个屏障,以营养吸收 ,必须先删除隔离的谎言下的上皮细胞。 以前的研究已经表明,主瘤胃上皮细胞可从用含有不同浓度的胰蛋白酶的解离解瘤胃中分离。 在我们的研究中,酶消化的五个不同的协议进行了检查(0.25,0.625,1.25,2.5,5%胰蛋白酶),以优化OEC隔离。 我们发现,2.5%胰蛋白酶是最有效的隔离,可行性和嗅鞘细胞在体外 (数据未示出)的粘附性。 它也难以分离,由于细胞响应于胰蛋白酶的敏感性的细胞; 例如,高浓度的胰蛋白酶是有害的细胞和低浓度不能充分有效地分离细胞。 此外,所需要的瓣胃薄层被切成1厘米2枚而不是捣碎,以避免肌肉或其他细胞的污染从更深的地层相关的上皮。 我们孤立的嗅鞘细胞的上皮起源的地层使用来自其中的细胞中分离的瓣胃的H&E染色证实。

在这项研究中,成纤维细胞和上皮细胞根据它们的不同的敏感性,胰蛋白酶进行分离,如先前报道。 以前,各种方法被用于抑制成纤维细胞的生长; 然而,这是不可能用这些方法完全消除这些细胞。 经过一系列的纯化步骤中,我们能够消除大部分污染的非上皮细胞(主要是成纤维细胞)的; 然而,一个小数目的成纤维细胞(细胞培养物不足10%)仍然存在与嗅鞘细胞。 以前的研究表明,非上皮细胞在培养物中的存在可能对上皮细胞的生长和存活的有益效果 。

在这项研究中,我们孤立的嗅鞘细胞表现出典型的鹅卵石形态与微绒毛,这也观察了其他隔离牛肠上皮细胞系的顶面和原代细胞。 此外,我们的细胞也确定了瓣胃上皮作为用电子显微镜进行评估,结果发现细胞间连接(桥粒和紧密连接)和张力原纤维,这也被在初级上皮细胞中观察到从牛瘤胃的存在和结肠上皮。 此外,该细胞具有不断增殖,形成融合单层,并表达PEPT1和细胞角蛋白18的能力,这些特性表明这些细胞的上皮性质。 此外,嗅鞘细胞在塑料基质上的生长表明一个群体倍增62 h的时间和呈现S形生长曲线( 图4 ),即正常的非转化的表型特征。 因此,这是更好接种细胞时,融合的单层一直合式后使用这些细胞进行研究,5天。

在嗅鞘细胞原代培养物,cuticularized细胞中出现了单层外面大部分区域,这表明我们的分离的嗅鞘细胞进行分化和成熟的体外类似于体内的上皮。 此外,嗅鞘细胞表现出拱顶状结构在融合后的阶段,这就出现零星地,当细胞在塑料基质上涂有胶原蛋白的生长。 这种结构已报道发展,由于流体的上皮细胞层的下部积累。 自发穹顶结构的嗅鞘细胞的形成表明,这些细胞发生分化和分泌基底膜成分相似的乳腺上皮细胞中报告之前的研究。

通过使用OEC模型研究小肽的吸收

PEPT1是一个H +的偶联肽转运蛋白。 我们的研究显示,嗅鞘细胞表达PEPT1的mRNA,并采取了GLY-SAR中的pH值依赖性为6.5的最佳pH值。 这些观察结果表明,PEPT1可能参与在嗅鞘细胞的小肽的吸收,而这种吸收是有效的,在生理pH值条件下在forestomach,这是约pH 6.0的奶牛 还已经报道,这些肽是由胃肠道通过的活性(转运介导的)和被动(旁细胞运动和细胞穿透肽)机制分两路吸收。 活动路由是由可饱和吸收的肽,而被动路由不饱 此外,激活的路由是温度敏感的,而被动路由不是对温度敏感的。 在这项研究中,甘氨酸基-Sar在细胞中的吸收是受温度的影响,并是饱和的基板,表明吸收是在肽转运部分地介导。 然而,我们的数据还表明,甘氨酸基-Sar是通过被动路由吸收嗅鞘细胞,因为摄取发生在4℃,且吸收呈现线性增加,对应的增加的浓度。 我们的动力学测定也表明,寡肽转运蛋白表现出高亲和力的底物,有效地发挥作用,在低浓度。

我们的研究还表明,该肽转运系统具有多种底物特异性,因为甲硫氨酸 - 甘氨酸能有效地抑制甘氨酸基-Sar摄取。 满足-甘氨酸已被证明是PEPT1的衬底在被转染的哺乳动物细胞系,并在中国仓鼠卵巢细胞 ,这进一步支持PEPT1在这些肽在嗅鞘细胞摄取的潜在参与。 在低浓度的Met-Gly组成,以抑制甘氨酸基-Sar摄取50%需要还表明,转运系统证明甲硫氨酸 - 甘氨酸的高亲和性。 最后,这些研究表明,我们的OEC模式是一个合适的系统来研究肽转运过程中反刍动物的forestomach。

总之,我们成功地建立和新生犊牛维持嗅鞘细胞的原代培养。 培养的细胞保留了上皮细胞的形态学和免疫学特性。 此外,嗅鞘细胞也可能占用小肽在体外和摄取依赖于底物浓度,温度,蛋白质,并且可以使用竞争者所抑制。 我们还观察到,PEPT1可以负责小肽在嗅鞘细胞的吸收。 嗅鞘细胞可以被用作各种营养素,包括小分子肽在牛forestomach的吸收机制的体外研究的一种重要模式。

致谢

作者感谢Ilkyu尹博士和凤起赵博士的有益的讨论和修改稿子帮助。 我们也感谢敬群袁女士,农业生物与环境学院浙江大学的技术人员,在使用实验设备提供方便。