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尼康显微镜拉姆达堆积和光谱特征

2014-04-26  发布者:admin 

 类似的概念来使用的激光扫描共聚焦或解卷 ​​积显微术高数值孔径物镜较厚的标本中获得的光学部分 (  z栈)中,lambda堆栈的三维数据集,它由使用相同的试样场的图像采集在不同的波长带,每一个横跨有限的光谱区域范围从2到20纳米的获取。 相反,在各种形式的光学显微镜的典型成像方案涉及在检测器的整个波长响应频带获取单个图像(或一个连续组中的延时实验图像)。 本教程探讨一个lambda栈的频谱分量。 

本教程初始化与包含从沾满EGFP的Alexa Fluor 488和SYTOX绿色出现在光谱窗口原子核捕获一个lambda堆栈中的各个光谱范围。 下方的光谱是单核的伪彩色图像,因为它出现的每个10纳米的波长频带中,具有发光强度是成正比的荧光基团的存在量。 混合光谱的图像呈现在本教程的右下角的角落。 为了操作的教程,使用LAMBDA堆栈段滑块通过各个波段翻译,观察混合后的图像,以及在光谱图中显示的强度比例。 一种新的荧光团(青色,绿色或橙色)可以与光谱轮廓下拉菜单中进行选择。

为了测量吸收染料,荧光基团,或者与多个标签完成试样的光谱,透射或发射的光被第一分散成它的组成部分的波长和强度的各波长的波长或很窄的频带进行测量。 光谱分辨率是依赖于每次测量的带宽,并增加作为采样通道decreses的带宽。 多种不同的技术可用于分散光,并且其中大多数已被施加的(至少在原型仪器)于显微镜的情况。 其中当测量光谱分辨率,波长范围和动态范围要考虑的最重要的特征。 光谱分辨率是由可以彼此区分开来,并且是高度精确的光谱成像测量的关键参数最接近的波长来确定。 光谱范围是指波长的总数(实际上,带宽)在一个特定的测量。 最后,检测限和动态范围定义必要的信号的最低水平进行测量和区分的等级数在一个特定的测量,分别。 所有这些值可以改变每个荧光团或吸光物质的光谱曲线的函数。

32通道光谱图像的lambda栈收购

图1所示是一个典型的组中的6纳米跨越500至692纳米的波长范围内,以产生含有32幅图像的lambda栈(在下面详细讨论)的顺序获得的带宽光谱图像。 该标本是贴壁人宫颈癌细胞(HeLa细胞系)细胞中的DNA和RNA用吖啶橙染色及成像与尼康A1光谱共焦显微镜系统的文化。 图像(512×512像素)采用32通道多阳极光电倍增管以每秒24帧采用488纳米激光激发的记录。 如此高的采集速度,这是显著益处在活细胞成像,通过先进的信号处理技术,加上快速模拟 - 数字转换电路,其操作以配合光电倍增管成为可能。