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奥林巴斯显微镜荧光探针的激发效率

2014-04-25  发布者:admin 

 一个荧光团的吸收光谱和荧光发射光谱分布是两个必须在激光扫描共聚焦显微镜的应用选择探头时进行审议的最重要的标准。 除了吸收和发射带的波长范围内,摩尔消光系数为吸收和量子产率的荧光发射应予以考虑。 在激光激发水平不饱和的荧光团,荧光强度成正比的消光系数和量子产率的产物。 这种互动式教学探讨如何这种关系可以被用来与特定的激光共聚焦显微镜荧光相匹配。

本教程初始化与光谱波长与相对强度的情节出现在窗口,并在图形上显示一个随机选择的荧光团的吸收光谱和荧光发射光谱图。 叠加在荧光激发光谱是最接近常见的共聚焦激光谱线来的染料的最大吸收的中央。 在这个波长,荧光发射在理论上是可能的最接近的最高值与所述激光,并在教程的荧光发射曲线包含在由荧光团的消光系数的乘积和的发光强度所允许的强度的电平指示的色彩频谱的填充。 在窗口下部的左角发光强度框呈现在最大波长与荧光发射最密切相关的颜色。

为了操作的教程,使用波长滑块来调整激光的选择了由荧光团的吸收光谱配置文件规定的区域。 滑块被限制在一个范围内的光谱的端部,并且只能行驶到最近的激光线过去这些边界。 作为虚拟激光线沿波长轴平移,教程计算出荧光团的摩尔消光系数和荧光量子产率的产物,并不断更新所得到的值作为发光强度框下面的百分比,以提供相对荧光的定性测量发射,可以在相应的激发波长可以预期的。 同样地,颜色的强度显示在排放强度框发生改变以反映荧光发射的在所选定的激光源激发波长的相对强度。 每个波长有关的激光源显示在以上波长滑块一个黄色的盒子,并从激光的特定谱线上方的滑块显示。 荧光类可以使用在窗口的右手侧上的单选按钮进行选择,个别的荧光团可以用选择的染料下拉菜单被加载到显示图形。

目前可用于共聚焦显微镜的荧光探针的数量在数百运行时,与具有与普通激光谱线密切相关的最大吸收许多染料。 一个特定的激光线和最大吸收的特定探针之间的精确匹配并不总是可能的,但线的激发效率接近最大通常足以产生可容易检测到的荧光发射的电平。 例如,在图1中的两种常见的探针的吸收光谱示出,随着最高效激光激发线。 绿色光谱是异硫氰酸荧光素(FITC),它具有吸收最大值的495纳米的吸收曲线。 的FITC荧光团在488纳米使用氩离子激光的激发产生约87%的发射效率。 与此相反,当477纳米或514纳米的氩离子激光线被用来激发FITC,发光效率下降到仅58或28%,分别为。 显然,在488纳米的氩离子(或氪 - 氩)激光线是最有效的源此荧光团的激发。

红色光谱在图1中是的Alexa Fluor 546,一个双磺化脂环呫吨(若丹明)衍生物与在556纳米,它是专门设计来显示增加的量子效率在光漂白的水平显著降低最大消光系数的吸收曲线荧光实验。 供的Alexa Fluor 546的最有效的激光激发光谱线是由氪 - 氩混合气体离子激光器,其产生约84%的发光效率的黄色的568纳米线。下一个最接近的激光谱线,从绿氦氖激光器的543纳米线和594纳米的线条从黄色氦氖激光器,激发的Alexa Fluor 546与43的效率和4%,分别为。 请注意,488纳米氩离子激光谱线激发的Alexa Fluor 546约7%的效率,一个因素进行双标记实验,同时FITC和Alexa Fluor 546的时候,可以关注。