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徕卡显微镜了解肾脏疾病和体内再生的动态过程

2014-04-17  发布者:admin 

 肾小球滤过屏障(GFB)是在肾脏glomerulis一个复杂的空间结构,其中超滤发生。 足细胞是GFB的关键因素,并参加在过滤过程。 它们已显示出参与了肾脏疾病的发展。 然而,由于技术限制,肾小球病变的机理还不是很清楚。 亚诺什PETI-Peterdi的研究小组在美国南加州大学开发出一种称为串行多光子显微镜(MPM)的新方法,它允许跟踪单个肾小球的命运在几天。 最近,它被公布为在自然医学的封面故事 。 在这次采访中,他对串行MPM如何影响他的研究意见。

你的论文做了它对自然医学的扉页。 所显示的图片,以及为什么它被选作封面? 是什么使得它特别的/有趣吗?

在封面页显示了生活小鼠肾脏的表面区域的视觉吸引力的,有代表性的多色彩图像。 图像被收购通过使用新生成的转基因小鼠,我们命名为podocin蛋白-五彩纸屑小鼠体内多光子荧光成像。 鼠标行单侧输尿管梗阻是肾脏纤维化的经典,常用的模型。足细胞,一个在肾脏中最重要的细胞类型,其中的形式和维持肾小球过滤器,被标记的四种颜色之一,基于基因编码的膜定位的CFP(蓝色)的细胞特异性表达,核GFP(绿色) ,胞浆YFP(黄色)或胞质RFP(红色)。 标记的葡聚糖(等离子染料)照亮了肾血管。 这项新技术有助于识别和跟踪相同的单足超过病程完整的活体肾移植的命运。 这对于识别和跟踪单足细胞未受影响肾脏的改进方法可以提高我们的肾小球损伤和再生的机制的理解。 我们相信,这种方法的新颖性和重要性帮助这个形象,我们的报告使它的封面。

时间可能也有帮助。 这是该杂志十二月号,因此节日。 在血管树的结尾多色标记肾小球看起来像圣诞树上的圣诞球。

请描述串行的MPM,你已经开发方面的研究完好肾组织的方法。 它是如何工作的?

为了更好地理解足细胞迁移的动态,我们在完整的小鼠肾脏在体内发展同肾小球串行MPM成像随着时间的推移,一旦每24小时。 串行MPM需要多个尚存,同样的动物的微创手术。 在麻醉小鼠左肾轻轻地从背侧切口被很好的耐受性通过动物相比传统的腹侧方法形象化和小鼠放置于加热的显微镜载物台,使用倒置显微镜MPM成像。 肾脏适于成像的区域被确定与肾脏的位置是注意到相同的位置上随后的日子里。

获得的Z-堆栈的肾小球后小遥远区域中的视场的特点是很快把激光束聚焦在具有高功率这个区域。 这个动作产生一个容易找到的高荧光点(​​参考点),它在那里停留3-5天。 相对于感兴趣的肾小球标记的位置被记录在案。 成像后,肾被放回腹膜后和侧面切口关闭与缝合。 这个过程重复在同一动物/肾小球24,48,72,等等小时后除去缝合线,并再次外缝合肾脏。 使用这种技术,我们能够随后找到被标记在所述第一成像会话的肾小球约70%。 收购具有相同的成像设置为前一天的Z-堆栈标记肾小球。

使用Leica TCS SP5的多光子共聚焦荧光成像系统,在860纳米(相干)和徕卡DMI6000乙倒置显微镜的外部nondescanned由一个变色龙超二MP激光器63X徕卡甘油浸入式物镜(NA 1.3)购入的图像探测器。 短通滤波器(680纳米的蓝色和红色,700 nm的绿色和黄色),分色镜(切断在515 nm的绿色和黄色,560纳米的蓝色和红色)和带通滤波器是具体的检测CFP / GFP / YFP / RFP发射(473纳米/ 514纳米/ 545纳米/ 585纳米)(色度)。

1:单足细胞未受影响肾脏podocin蛋白,五彩纸屑用鼠标在体内多光子荧光成像的识别和跟踪。 肾小球毛细血管袢外足细胞被标记的四种颜色之一,或者通过膜定位的CFP(蓝色),核GFP(绿色),胞浆YFP(黄色)或细胞内的RFP(红色)。 标记的葡聚糖(等离子染料,灰度)照亮了肾血管。

 

有什么困难呢? 什么是新约的串行MPM?

肾小球滤过屏障(GFB)具有由几种不同的细胞类型,包括特殊的间质细胞称为肾小球系膜细胞,内皮细胞,足细胞,并形成了一个非常复杂和动态的三维结构。 足细胞是GFB,在肾小球毛细血管一个复杂的血管部,其血浆超滤的关键要素。 足细胞是高度分化形成围绕毛细血管袢的外面长的初级和次级的扩展,包裹细胞。 它们的相互交叉的足突之间的狭缝状光阑形成这是GFB的一个关键组成部分。 最近的基因和细胞生物学的研究强调了在肾小球疾病的发展足的极端重要性。 不过,在了解肾小球病理的机械细节的一个关键障碍一直是技术上的限制,研究GFB在其原生环境。 由于体内缺乏数据,仍有显著差距,我们的足细胞动力学和运动及其链接蛋白尿和肾小球硬化的理解。 然而,这种洞察力,将需要新的治疗策略的发展。

高分辨率成像工具的应用,尤其是该系列的MPM方法可以提供长期失踪的体内技术足细胞研究。 MPM是一种革命性的,微创光学切片技术,它允许在小鼠肾脏包括体内肾小球的成像。 串行MPM代表了一种新的技术进步这使我们,对于第一次,肾小球疾病的过程中,以可视化的完全相同的足细胞/肾小球区域(组织体积)在几天的完整活肾。 没有任何其他现有的技术能够实现这一目标。 优点包括(i)克服肾小球异质的问题,(ii)建立的动力学和细胞迁移,组织重塑和(iii)与功能性的测量相结合的图案。

你是通过串行MPM取得哪些新的见解,你是不是能够得到这样呢?

串行MPM成像是有助的在描绘,第一次,动力学和肾小球形态学,细胞成分,并常在24小时之前的成像会议内发生足细胞突起的巨大变化。 我们发现的证据,足细胞远离自己平时解剖位置的迁移,从肾小球一簇。 我们的数据支持高动态(新范式),而不是静态的性质肾小球环境和细胞组成(目前教条)。 此外,一个新的解剖学发现是连接内脏(足细胞)和顶叶皮层(胸肌)可能参与细胞 - 细胞通讯和细胞迁移的纳米管的第一可视化。

是如何串行MPM改变你的研究?

新型小鼠模型用荧光细胞谱系标记序列的MPM是一种新型的,先进设备,最先进的独特的,成像的方法,我们将继续利用我们的研究,直接和定量可视化不同肾细胞类型的招聘和命运体内和解决它们的功能和作用在肾血管和肾小球重塑在健康和疾病。 到目前为止,我们已经开发了几种新的转基因小鼠模型中,七种不同肾细胞类型可以由基因编码的,多色荧光蛋白的表达特异性标记。

与串行,活体成像的MPM技术突破相结合这一新的工具箱是一个巨大的技术进步为我们的研究计划,并允许我们,并会继续让我们来研究正常和病变的肾脏功能的动态的活体肾在前所未有的细节。 这种新技术的应用使我们能够产生几个高度创新的理念和方法,包括新的,非传统的机制和作用于许多不同肾细胞类型的鉴定和表征。

在干/祖细胞研究的新进展带来了新的视角和专注于组织再生和生物医学科学的多个领域,包括肾脏和心血管(病理)生理细胞命运的改变。 新颖的技术已经成为可用的细胞系和不同器官单个细胞的命运跟踪的荧光标记。 我们将利用这些惊人的研究工具,结合串行MPM来推进我们的功能和肾功能的特定细胞类型(如致密斑的足细胞,细胞,肾素分泌细胞,肾小管上皮细胞,毛细血管和淋巴管内皮细胞的命运的理解,间充质祖细胞,等等),它是肾和肾小球功能(如肾小球滤过,肾血流量,肾小管分泌和再吸收),肾素 - 血管紧张素系统的关键部件,并且还重要的参与者肾脏病理学的重要调节剂。

 

什么是方法的未来的可能性?

除了跟踪细胞迁移和命运变化,肾脏疾病中组织重塑的时间动态的,我们可以使用串行MPM成像疾病的过程中了解的变化,细胞内和细胞 - 细胞信号传导。 例如,小鼠足细胞中的基因编码的钙指示剂GCaMP3的细胞特异性表达系列MPM成像是最近成立在我们的实验室。 这种新方法使我们能够肾小球硬化和肾纤维化的发展过程中定量可视化钙升高的足细胞,并在肾小球滤过,血管通透性,与足细胞损伤和病理的传播病理改变他们的致病作用。

说明体内这种技术进步,足细胞钙成像的文件目前正在印刷中的临床研究杂志。 与肾脏结构和功能的串行MPM成像相结合,新颖的酶Cre /液氧为基础的转基因方法将帮助我们在今后的工作中特别标注,操作(消融)细胞在体内的肾脏完好,敲出特定基因特别是在某些细胞类型(条件性敲除小鼠),并分析其在健康和疾病的肾功能和肾血管和肾小球重塑的作用。 使用未来的,不断发展的成像技术和预期进一步推活体的限制,许多肾细胞类型,包括足细胞的功能性成像方法(如长波长的红外激光,极敏感探测器,超分辨率纳米显微)。