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尼康显微镜共振扫描激光共聚焦显微镜教程

2014-04-13  发布者:admin 

 为了获得往往需要通过活细胞成像的速度更快的时间尺度图像,激光扫描共聚焦显微镜必须重新设计,以结合了先进的扫描方案,使光束是光栅扫描以更高的速度穿过标本。 为了克服传统的共聚焦显微镜固有的速度慢,一些制造商已经推出了搭载了能够采集图像以每秒或更高的30帧的共振扫描镜仪器。

 

本教程由初始化显示共振扫描仪像素时钟激光束叠加在拉伸伦奇光栅(长黑线)的余弦格局。下方的扫描图案是通过光栅和扫描过程中所产生的像素时钟计数传送的光的强度。 该图的左手侧示出了正向扫描,而在右手侧示出了在反向扫描。 注意,本教程的速度得到了大幅为了证明在共振扫描所发生的各种事件减少。 作为扫描的进行,典型的标本中示出的图像扫描窗口。 水平扫描镜的角度也被指示为是从相对于所述伦奇光栅的像素时钟激光的反射光束的位置。 为了操作的教程,请单击扫描图片按钮启用手动更改到X扫描Y扫描滑块。

由于非线性谐振扫描器速度,荧光样品被扫描在中央区域中的最高速度,该速度逐渐减小的扫描到达边缘。 作为一个结果,当从一个谐振扫描器产生的图像数据流的获取与一个图像采集卡主频为一个恒定的像素率(假定光束扫描线)时,图像出现拉伸的边缘。 此外,激光的激发强度(大于在边缘处)的不均匀分布产生的,因为增加的暴露于激光的过多的光漂白(和潜在的光毒性)在扫描区域的边缘。 用于补偿扫描非线性的最简单的办法是限制扫描范围的那部分的振荡周期,其中该检流计的速度几乎是线性的,这发生在跨越约70%的总的扫描宽度的一个区域。 不幸的是,这种解决方案减少的时间发射的信号可以被收集的量,增加扫描周转时间之前信号可以被再次收集,并且不阻止在光漂白落在被记录的区域以外的样品的区域。光漂白的效果可以但是最小化,通过引入一个可调节孔,以限制暴露于光照样品的区域使用检流计振荡的线性部分时。

诱导的非线性谐振振镜扫描图像失真是幸运的可预测的和可使用软件或硬件的解决方案被校正。 不论所涉及到产生图像的校正方案的,最有效的扫描策略包括在检流计镜的正向和反向扫描采集数据。 前向扫描过程中记录的数据是简单的,但是由于该反向扫描反转,其中像素被记录在方向上的事实,图像数据必须使用专门的读 - 写缓冲器或软件被倒置。 在实践中,图像被聚集在普通宽度的两倍(实际上,1024像素的最终图像512×512像素大小)和一半的正常高度(256像素)。 在谐振电反射镜的每个正向X轴扫描结束时,提供给线性(y)的电流计的垂直锯齿波信号是由1行和反向(x)的扫描开始递增。 在这种方式下,垂直扫描顺利的为256个周期,直到足够的数据供一个图像被获取。

共振扫描仪时钟问题

软件和硬件时钟的共振扫描共聚焦显微镜解决方案依赖于明知位置数据的高频谐振电流镜。于7.9千赫兹器件,该反射镜可以在围绕中心轴(总共24度的旋转),每个方向旋转约12度。镜子的角位置(θ)和相位或速度(φ)的关系可以根据振荡周期的状态进行预测。 在一个振荡周期的开始(镜位置等于正负12度,参见图1)的反射镜是固定的速度等于零。 作为反射镜摆动朝向中点,角速度随着相位的余弦函数和达到最大时的反射镜的角度为零。 继续,反射镜会减慢再在接近正向扫描的结束,直到它到达一个速度等于零,因为它瞬间反转方向。 在角速度相同的变化被观察为在相反的方向上的反射镜的旋转。 应当考虑与谐振电流计的另一个因素是,这些设备是高Q值的振荡器和不能有效地同步到一个外部频率,由于在相位和时,即使最轻微的漂移的自然振频率和外部之间发生振幅大的响应变化驱动源。 因此,谐振电流计本身应被用来作为主振荡器,而所有其它部件的定时是同步的。

对于谐振扫描共聚焦显微镜的基于软件的时钟方案涉及的算法,其能够使用基于反射镜的可预测的运动的查找表像素数据线性化。 作为一个实例,一种流行的算法首先确定一个相位不变的镜子和帧接收器,然后定位到最终图像的中心像素。 该算法运行周围对称,其中反射镜的位置是已知的具有高精确度的中心平面。 图像是通过检查一个水平扫描线在它们被输送到帧抓取器一次处理。 像素数据被存储为从扫描仪在最终的图像宽度的两倍和一半的最终身高接收。 在这个过程的第一步涉及从水平扫描行的第二半反相数据点,随后交错的数据线之间的反码数据的第一图像的一半(图1(b))。 因为该图像的中点可能不肯定地知道,由于收集数据,触发采集的水平同步信号和开始之间的时差,它往往是必要的软件由几个像素来抵消反相扫描线。 在这种情况下,扫描线的右边缘,然后用作用于图像的参考点。 序列中的下一个步骤是应用一个校正因子为每个像素或相位位置相对于中心像素。 该象素,然后重新定位到最终图像(图1(c))的正确位置。 在理想情况下,利用先进的高速计算机,输入的数据可以在飞行中进行分析和记录实时硬盘。

在谐振电流计的水平扫描期间,定时寄存器光电二极管的激光的散射的伦奇光栅可以被电子地变换为具有可变频率的像素时钟脉冲。 这些光脉冲将更加频繁的时间时,检流计镜处于其振荡周期的中央部分,但由于反射镜到达扫描结束和反转方向就会慢下来。 其中所述光电二极管检测器的要求是处理可变脉冲频率(在带宽方面),它必须足够大,以检测整个扫描线的能力。 该检测器被连接到一个跨导放大器,转换光电二极管的电流脉冲转换成一个放大的电压,然后将其馈送到一个加倍每行的像素数的倍频电路。 光电二极管和相关的电子器件提供256个脉冲,每行和倍频电路将这个输出到512个脉冲,每行是由一个帧抓取器获得并用于构建图像。

龙基光栅像素时钟

示于图2是基本概念的使用伦奇耦合到一个光电二极管检测器光栅作为一个变量像素时钟后面的图示。 为清楚起见,在图2所示的光栅(一)仅包含8叠加有来自谐振电流计随时间变化的余弦波运动的一个完整的周期等于宽度的间隔(红色曲线; 125微秒)。 实际光栅具有256线的间距,并且由于该像素时钟激光实际上折回单行(垂直于不透明线)跨越在操作光栅表面(图2(b))的事实更为紧凑的线性尺寸。 作为光束进入和离开伦奇的清晰区域光栅,是由光电二极管检测到的上升和下降中的步骤与检流计的运动(图2(c))的透射光强度。 由光电二极管检测到的光强度的每个过渡(在这种情况下,从暗到亮),用于生成像素时钟(图2(d)),通过在显微镜触发图像捕获。 虽然在图2(d)示出的时钟脉冲的非均匀间隔的时间(从约70到160毫微秒),但是,它们分别对应于图像空间相等的间隔。

为了获得象素取样以相等的空间间隔(而不是在时间上相等增量),从主显微镜成像系统,光电倍增管的信号通过可变增益放大器的常规和偏移量,并且然后由一个模拟 - 数字转换器进行数字化触发通过从伦奇光栅脉冲产生的像素时钟。 然而,有一半的图像信息的原因在于,在谐振电流计扫在两个方向上的事实相反。 为了构建一个图像之前,以纠正这种双向扫描神器,数字像素输出被首先转移到任何一个先入先出(FIFO)或后进先出(LIFO),缓冲取决于是否从左至右或从右到左被收购像素。 由此,检流计镜的水平扫描期间,即在产生的第一扫掠(62.5微秒的时间段)的一半所获取的图像的像素被馈送到FIFO缓冲器,而在反向扫描期间所获得的像素被馈送到后进先出缓冲区。 FIFO缓冲器被读出和复位到零在每个水平行采集的开始,而后进先出缓冲器中存储输入的数据,并随后读出期间向下计数,以确保在反向扫描期间所获得的像素被反转。