设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

徕卡显微镜GSDIM 样品制备- 协议和技巧

2014-04-03  发布者:admin 

 广角超分辨率技术GSDIM(基态耗尽之后个别分子返程)是一个定位显微镜技术,其能够解决细节小至20纳米。 GSDIM适用于范围广泛的样品。

生长在标准玻璃盖玻片上的细胞,例如后化学固定都可以使用。 此外组织切片可为GSDIM来制备并放置在玻璃盖玻片。 样品通常是通过荧光免疫染色或其它合适的技术标记

 

免疫荧光

与准备与衍射极限的荧光显微镜优化的标准免疫方案样品开始应该已经提供令人惊叹的超分辨率图像。 为了获得最佳的GSD图片,可能需要增加抗和二抗的浓度,以达到更高的标记密度。 增加标签密度,确保感兴趣的结构充分沾上荧光。 结构稀疏的标签可能会导致您的图像的点状外观。 为了减少在GSD图像的非特异性背景信号,它可能需要增加时间用于阻断样品以及阻断试剂的浓度。 这是应彻底清洗你的样品(例如,通过增加洗涤步骤的数量和时间)。

双彩屏染色徕卡Microsystems建议一)AlexaFluor 532与AlexaFluor 647,B)AlexaFluor 555与AlexaFluor 647或c)阿托488或AlexaFluor 488与AlexaFluor 647的组合。

1:高尔基体膜蛋白Giantin和高尔基体基质蛋白GM130,免疫荧光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488,分别。 礼貌靖冈田博士,细胞生物学教研室和解剖,医学研究生院,东京大学,日本。 
2:MDCK细胞:微管,AlexaFluor 647(红色)和TyrMicrotubules,AlexaFluor 488(绿色)。 礼貌教授拉尔夫·雅各布,菲利普斯大学马尔堡,德国。
 

结构保存

一个特定的蜂窝结构体的保存强烈依赖于固定方法。 确切的固定方案,应针对感兴趣的结构进行优化。 对于大多数结构的多聚甲醛/甲醛固定就足够了。 除了多聚甲醛/甲醛作为fixant少量戊二醛(0.05%至0.2%(体积/体积))的可强烈提高结构保存。戊二醛可诱发一种朦胧的荧光背景,因此与铵淬火, 氢化钠或其它合适的试剂推荐。 甲醇固定是很常见的微管保存,但可能不足以为其他结构。

盖玻片

超分辨率成像需要在整个光学系统的良好的光学性能 - 不仅在显微镜和物镜。 盖玻片是对成像效果高冲击的主要参数。 以获得最佳的超分辨率图像质量的扁平盖玻片是必需的。

不幸的是,虽然是不加批判的标准广角应用,不是所有的腔盖玻片的产品可以保证最佳的平整度就GSD的程度。 此外,腔盖玻片的产品可能不适合高分辨率成像提供必要的机械稳定性。 相应的产品应该由研究员为他们的适应性测试。 一个更好的平整度和高稳定性可通过在玻璃盖玻片,例如在特别设计的盖玻片持有者的无应力安装通常被实现。

在我们的情况下,我们为简单和扁平推荐的另一种方法盖玻片安装专门用于GSD成像利用高精确度的盖玻片和硅酮胶来固定和密封所述样品(参见下文)量身定做。 
 

嵌入

包埋剂 - - 每个荧光团与它的直接环境相结合的固有特性决定了基态损耗的能力,以及对单分子的回报率。 有了它,包埋剂效力于成功的GSD成像至关重要的作用,并具有与利用荧光对齐。 到现在下面越来越多的机会是适用的。

包埋剂1 - MEA在PBS

试剂

  • β-巯基乙胺(MEA)(例如,Sigma-Aldrich公司,#30070,也被称为半胱胺)
  • 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中
  • HCl / NaOH调节pH调整 
     

缓冲

PBS中含有10mMβ-巯基乙胺(MEA),调节至pH 7.4。 溶解的β-巯基乙胺在PBS中并调节至pH 7.4。 β-巯基乙胺的浓度可以改变,在很宽的范围内,以优化GSD图像 - 使用范围一般是10和100毫米之间(建议浓度为测试31/30/100毫摩尔)。

β-巯基乙胺溶液必须在使用前新鲜配制,另外,储液可制备并储存于-20℃并在使用前刚解冻。 冷冻的等分试样可被存储在几个星期。 
 

照明

EPI:是 
全内反射荧光:是 
 

激光(波长)

染料

生产厂家

488

AlexaFluor 488

生命技术

 

阿托488

西格玛

 

做Chromeo 488

Active Motif

 

俄勒冈绿488

生命技术

 

做Chromeo 505

Active Motif

532

阿托520

西格玛

 

AlexaFluor 532

生命技术

 

AlexaFluor 555

生命技术

 

AlexaFluor 568

生命技术

642

阿托633

西格玛

 

AlexaFluor 647

生命技术

 

阿托647N

西格玛

 

阿托655

西格玛

 

AlexaFluor 680

生命技术

 

AlexaFluor 700

生命技术

包埋剂2 - 葡萄糖氧化酶

试剂

  • 葡萄糖氧化酶(如Sigma-Aldrich公司G2133)
  • 过氧化氢酶(如Sigma-Aldrich公司C1345)
  • 葡萄糖
  • 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中
  • 的HCl / NaOH调节pH调整 
     

缓冲

PBS中含有10%(重量/体积)葡萄糖,0.5毫克/毫升葡萄糖氧化和40微克/毫升过氧化氢酶调节至pH 7.4。 
注:建议准备一个葡萄糖母液和安装盖玻片前新鲜混合试剂。 
 

照明

EPI:是 
全内反射荧光:是 
 

激光(波长)

染料

生产厂家

532

阿托532

西格玛

 

AlexaFluor 532

生命技术

 

AlexaFluor 555

生命技术

 

罗丹明6G

Active Motif

 

阿托565

西格玛

 

AlexaFluor 568

生命技术

642

阿托655

西格玛

 

AlexaFluor 680

生命技术

包埋剂3 - 聚乙烯醇

试剂

  • 聚乙烯醇(PVA)为25000,分子量,88%(摩尔)水解(例如Polysciences的,#02975-500)
  • 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中
  • 的HCl / NaOH调节pH调整 
     

硬件

Spincoater 
 

缓冲

制备在PBS中的1%PVA溶液。 将pH调节至7.4。 
 

旋涂

将盖玻片上的spincoater及干燥,短暂5-10秒旋转盖玻片在约 3000转。 滴50微升的PVA溶液的样品上并旋转该样品在约 3000 rpm离心约30秒。 让该PVA膜干燥几分钟并装载样品。 可将样品在室温下保存,并用于GSD成像长达三个月。

没有额外的安装介质是必需的。 PVA膜,保护样品。 
 

照明

EPI:是 
TIRF:不可能 
 

激光(波长)

染料

生产厂家

488

AlexaFluor 488

生命技术

 

阿托488

西格玛

 

做Chromeo 488

Active Motif

 

俄勒冈绿488

生命技术

 

阿托520

西格玛

532

AlexaFluor 532

生命技术

 

AlexaFluor 680

生命技术

包埋剂4 - 的Mowiol

试剂

  • 甘油(分析纯)
  • MOWIOL 4-88(例如Calbiochem公司#475904)
  • 蒸馏水
  • 的HCl / NaOH调节pH调整 
     

包埋剂

  • 开始6克甘油
  • 添加2.4克4-88的Mowiol
  • 添加6毫升水族dest中。
  • 添加12毫升0.2M的Tris缓冲液pH值8
  • 搅拌4小时(磁搅拌器)
  • 让我们暂停休息2小时
  • 孵育10分钟,在50℃(水浴)
  • 离心机在5000×g离心15分钟
  • 取上清液,并在-20℃下冻结它在等分 
     

照明

EPI:是 
TIRF:不可能 
 

激光(波长)

染料

生产厂家

488

阿托488

西格玛

 

做Chromeo 505

Active Motif

532

AlexaFluor 532

生命技术

 

罗丹明6G

Active Motif

 

阿托647N

西格玛

642

阿托655

西格玛

 

AlexaFluor 700

生命技术

包埋剂5 - 的Vectashield®

试剂

  • Vectashield®(如Vector Laboratories公司,#H-1000)
  • 50牛米三甘油中
  • HCl / NaOH调节pH调整 
     

缓冲

  • 的50mM Tris /甘油含有缓冲液的10%的Vectashield®调节至pH 7.4。
  • 三溶解于甘油准备一个50毫米原液。 混合10%的Vectashield®与90%的Tris /甘油缓冲。 调节pH至7.4。 样本可以被存储在数周,在4°C。 
     

照明

EPI:是 
TIRF:不可能 
 

激光(波长)

染料

生产厂家

532

AlexaFluor 555

生命技术

642

AlexaFluor 647

生命技术

包埋剂的YFP

GSDIM适合创建使用荧光蛋白的超分辨率图像。 如荧光蛋白YFP /金星惊人的显示效果。 此外,其他的荧光蛋白质应与该技术(包括GFP)。 要结合与基因编码的融合蛋白的优点有机荧光电源(例如,如果没有合适的抗体可用),使用标记,如SNAP-,卤素或CLIP-标签建议。 这些标记可以遗传地与感兴趣的蛋白质和后标有有机荧光团(例如,固定和透化后)。

下面的水嵌入被成功用于图像YFP在固定和通透的哺乳动物细胞:

  • 过氧化氢酶SIGMA,C1345 40微克/毫升
  • 葡萄糖氧化酶SIGMA G2133 0.5毫克/毫升
  • 葡萄糖10毫克/毫升
  • β-巯基乙胺(半胱胺)1毫米
  • 在PBS中稀释,调节至pH 7.4 
     

安装

徕卡Microsystems建议安装盖玻片直接对抑郁症的幻灯片样本。 盖玻片应该固定在凹部滑动,并与双组分硅酮胶Twinsil®(Picodent,维佩菲尔特,德国,#13001000)密封。 Twinsil®是无毒的,快速硬化,并且可以在稍后容易地除去,例如,重新装载样品。

  1. 加90微升水包埋培养基(MEA中,葡萄糖氧化酶,混合或的Vectashield®)到一个干净的抑郁滑动的空腔。 
    (对于嵌入媒体PVA和LR-白:离开抑郁症幻灯片的腔体为空。)
  2. 将您的样品的玻璃盖玻片上的抑郁症幻灯片的腔。 样品应面对腔。 盖玻片应完全覆盖抑郁症。
  3. 如果水性包埋介质被填充在腔体中,确保没有气泡存在。 否则,小心地取出盖玻片,并重复上述步骤。
  4. 无液体应该出席的地区,应胶水覆盖(Twinsil®)。 小心地用滤纸除去残留的液体。 对于嵌入媒体1,2和5:确保没有缓冲区是从水库浸泡出来。
  5. 混合的Twinsil®黄色和蓝色分量的1 +1彻底的数量,并把它应用到玻璃盖玻片的边缘不直接接触盖玻片。 
    用于水性嵌入媒体:与Twinsil®完全密封盖玻片。 
    嵌入媒体PVA和LR-白:密封盖玻片约。 75%,其余的四分之一开放,允许通风,避免对样品冷凝。
  6. 5-10分钟后的双组分胶硬化和试样准备GSD成像。 
    该胶可在不硬化(如交换成像缓冲区)后不留痕迹在玻璃上很容易地删除。

AlexaFluor®是生命科技的注册商标™。

安装步骤

1)移液管约。 90微升的液体包埋介质(例如,MEA溶液)放入凹陷滑动的空腔。

   

2)将圆形盖玻片 - 抱着免疫染色样品 - 到介质上,并避免气泡的形成。

   

3)轻轻按压在盖玻片,以去除气泡(如有必要)和过量的缓冲液。

 

混合使用这两种成分- Twinsil硬化®开始混合。

4)小心地取出液体不从抑郁症幻灯片水库浸泡缓冲区。

5)通过仔细地适用Twinsil®密封盖玻片。 请勿触摸或移动盖玻片!

6)当硬化(约5分钟)Twinsil®是轻轻地用尖感动,也不会粘也不能推到一边。

   

 

 

影像学提示

双色染色

徕卡推荐的组合

一)AlexaFluor 532与AlexaFluor 647 
二)AlexaFluor 555与AlexaFluor 647 
三)阿托488或AlexaFluor 488与AlexaFluor 647

对于连续双彩色成像。 请先图像的红色通道(AlexaFluor 647)。 徕卡不建议在开始成像绿色/橙色通道(如AlexaFluor 532),以避免AlexaFluor 647,它可以是漂白 - 虽然在非常低的水平 - 兴奋由488纳米(或532 nm)的激光。 如果打算使用其它荧光团为双染色的样品时,请确认这两个荧光团可以相同GSD成像条件(包埋介质)下进行成像和串扰是微不足道的。

3:PTK2细胞AlexaFluor 647染色的微管在绿色红色和AlexaFluor 488染色网格蛋白。 礼貌教授斯特凡地狱,马克斯 - 普朗克生物物理化学研究所,哥廷根,德国。

 

利用405 nm激光

徕卡SR GSD配备一个405nm的激光器。 在关断状态的荧光团的寿命可以通过用UV光还照射样本被缩短。 较短的寿命会导致导通状态的增加荧光基团,因此可用于增加每帧检测到的事件的数目。 通过保持每帧的事件在一个最佳的范围内的数,可以是a)有效地检测分离良好的单荧光团和b)保持获得的超分辨率图像短的时间,因为它有可能积聚所需数量更少的图像内的事件。

当获得双彩色图像的较长波长信道,必须小心使用405 nm激光是很重要的! 在405nm的波长可激发的绿色染料,因此漂白较短波长的荧光基团而获得的较长波长的超分辨率图像。 最佳设置应分别为每个样品类型而定。

 

活细胞超分辨率成像

最近的报道已经研究GSDIM(也称为dSTORM)的图像的活细胞中的适用性。 在一般情况下,它是可能的,研究活细胞与Leica SR GSD,而是光毒性 - 如所施加的高功率激光的结果 - 和感兴趣的观察期内结构的动力学应仔细控制。