设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

徕卡显微镜单细胞分析激光显微切割后

2014-03-28  发布者:admin 

 Morbus (M.) 得老年痴呆症后, M.Parkinson是第二个最常见的进行性神经变性疾病。 前的最初症状显现出来,高达70%的中脑多巴胺释放的神经元已经死亡。 生物学博士。 哼哼。 福尔克施劳德拉夫(德国乌尔姆大学的一般生理研究所)用现代激光显微切割的方法来从M.Parkinson患者为了获得分子洞察疾病采取验尸组织标本分离和分析细胞。

 

M.Parkinson研究

M.Parkinson的特征标志是多巴胺能神经元在中脑的恶化,特别是在黑质 (SN,黑色物质)。不同的原因和这种疾病的形式已经确定。 在基因家族形式的情况下,例如,它一直未能识别出具有分枝Parkinson因果影响的各种基因。 但是,我们仍然不知道是否所有相关的基因已被确定,或者他们对发病机制究竟是如何作出贡献。

对于如何在疾病起源有几种说法。 M.Parkinson可以比作一个谜。 我们已经发现了许多的作品,并可以把一些他们在一起,但我们不知道是什么的全貌样子。 我们还没有制定出一些作品的意义的是,我们也不知道有多少的拼图碎片,我们仍然需要找到之前,我们可以提出M.Parkinson的全貌,并真正了解这种疾病。

我集中在黑质多巴胺能个人脑的神经元的基因表达分析。 这些细胞选择性退化,因为他M.Parkinson病的进展。 一旦患者注意到M.Parkinson的主要症状,如静止性震颤是本病的特征,超过70%的多巴胺能神经元的SN都已经死了。

我的一个研究的目的是开发最优化的qPCR(定量聚合酶链反应)为基础的方法,使有效的从M.Parkinson患者的基因表达人类验尸组织有前途的候选基因中单个神经元的基因表达的比较从健康对照组相同的神经元。 我们开发了一种定量PCR为基础的平台,它可以被用来分离单个细胞的天然组织和获得高度可比的基因表达分析。 我们的分析,例如试样中的RNA的质量,表明结果的质量不被染色工艺和激光显微切割的影响。

实验过程

1:流图的实验程序。 流程图表示的协议用于UV LMD和定量RT-PCR的基因表达来自人死后的大脑PD和对照个体的SN多巴胺神经元的分析的实验过程。 发表于:核酸研究1-16(2008); DOI:10.1093/nar​​/gkn084,版权所有:牛津大学出版社。

 

在黑质多巴胺能神经元

不同的验尸样本的分析都像在 M.Parkinson的特定阶段的快照。 我可以相互比较这些快照。 但我不能使用这些样本来检测一个改变基因的表达是否是结果或疾病的原因。 我们需要做的关于这个问题的进一步研究。

我检测基因表达的M.Parkinson患者的选择性多巴胺能神经元的策划改变。 这种变化影响到参与多巴胺代谢的调节以及基因离子通道代码基因。 我们发现,例如,涉及的合成和提供多巴胺在存活的多巴胺能神经元的数个基因的高表达。 我们还研究了离子通道,调节多巴胺能神经元的活性不同的基因表达模式。 在这里,我们注意到,在某些分枝Parkinson病患者的研究基因的表达的改变。

2A:单个神经元的UV-LMD。 (A)左图:cresylviolet(CV)染色小鼠脑冠状部分前(左)后(右)紫外激光显微切割整个区域的指示的黑质致密部(黑质)的区域。 右侧面板:定性逆转录(RT)多重巢式PCR产品,适用于整个LMD黑质凝胶电泳结果。 用于RT-PCR信号的所有八个不同的多巴胺能(TH,DAT,GIRK2,D2S / l)和nondopaminergic(GAD,GIRK1,GFAP,CB)的标记基因,多巴胺,GABA能和神经胶质细胞的异质细胞混合物中检测到。 (DNA梯:100-bp的标记)。

 
2B:上:CV-染色紫外lasermicrodissection 15个人DA能神经元后冠状脑部分。 中:选择和激光显微切割从上部的个人神经元。 较低:个别神经节(左)和上限控制的UV-LMD后(右)展示成功分离。 
2C:PCR产物的定性多重RT-巢式PCR凝胶电泳个别LMD SN DA能神经元和小SN DA池后。上部和第二屏:多巴胺能标记基因(TH,DAT,GIRK2,D2,不GIRK2,GAD67,GFAP)相似的基因表达模式的20个游泳池和一个SN DA能神经元的敏感性说明协议和特异性。 第三小组:表达一个人钙结合蛋白阳性CB(+)SN DA神经元(D和E)采用cDNA的10%,由15鼠标SN DA能神经元池为ENO2基因表达的实时定量RT-PCR分析简介模板。 神经元的UV-LMD-收集从新鲜或存储(1周),并重新用于组织切片。
 
 
 2D:代表实时PCR跟踪测试ENO2表达,在对数尺度的相对荧光水平的绘制对PCR循环(ΔRN:相对荧光,归一化到内部的荧光标记的ROX);阈线为阈值的周期确定扫描(CT )所指出的绿线(ΔRN 0.4)。 
2E:ENO2检测水平(CT)从新鲜和冷冻组织切片(新鲜SN DA细胞池之间无显著差异NS:34.43 + / - 0.51,N = 10;再利用:34.62 + / - 0.48 N = 9 ,P = 0.785)。 发表于:核酸研究,2008年1-16 DOI:10.1093/nar​​/gkn084,版权所有:牛津大学出版社
 

激光显微切割的影响

在过去的几年中已经出现了比较M.Parkinson患者健康组织的黑质的完整组织标本许多研究。 然而,这种比较是误导性的,因为在这些患者中,有70%认为有明显参与了疾病的神经元已经堕落在其发病。 此外,所述组合物和被检查的脑组织切片是非常不均匀的。 所以我们做了到现在为止的“组织”的做法是像梨比较苹果。

我们希望有选择地查看所涉及的致病过程,并使用激光显微切割为在单细胞水平验证比较中脑多巴胺能神经元。 这种技术使得能够精确地切割个别的多巴胺能神经元的输出复杂的组织,没有接触或污染,并分析单个细胞的基因表达。 最常见的类型组织中的大脑是支持组织:神经胶质细胞是10至50倍,比我们都没有激光显微切割感兴趣的神经元比较常见的,这将是几乎不可能清晰地刻画比较少见的神经细胞上的分子水平,他们将无法从背景噪声区别开来。

单个细胞的分析通常会导致从那些从一个完整的组织检查获得不同的结果。 研究表明,某些微RNA的表达在M. Parkinson病患者的组织发生变化。 我们追踪这些语句之一,起初我们能够确认的结果为整个组织。 但是,我们也同时在显微检测细胞。 在这里,我们发现,微RNA的表达没有在单细胞水平改变。 该组织神器是用激光显微切割的辅助检测。

我们使用激光显微切割系统,它使单个细胞的无接触解剖或者,如果需要的话,更大的组织的区域。 解剖的材料被捕获在一个管的盖子,并且可以立即进行处理。

3:LMD和人PD个别SN DA能神经元的基因表达分析和控制死后的大脑。 的neuromelanin阳性[NM(+)]的神经元(A和B)池是通过从PD(A)cresylviolet染色水平中脑冰冻切片LMD分离和大脑控制(B)。 上图:从黑质NM +神经元的小水池LMD后Parkinson病(A)和对照组(B)冰冻切片。 较低的面板:代表PD(A)和对照组(B)黑质新墨西哥州(+)神经元前(左)和解剖后(右)。 插入:UV-LMD后帽控制。 比例尺:250毫米,20毫米,分别为。 (三)分散的a-synuclein基因的表达,水平PD和控制大脑的情节。 α-突触核蛋白基因的表达15海里(+)和TH(+)黑质神经元被给定为PG-当量从每个细胞人类SN-组织(标准曲线定量)由来的总cDNA的每个池,通过定量实时确定实时PCR。 棒表示平均每个brain_SEM的黑质池的a-synuclein的表达。 (四)情节的意思的a-synuclein基因水平(_SEM)针对每个大脑中的RNA的完整性数目。 脑银行代码表示相邻的点(参见图5C和表1)。 (E)之间的线性意味着-突触核蛋白的表达和RNA的完整性号所有个人分析控制和PD大脑回归分析显示无正相关关系组织的高品质的RNA之间以及检测到-突触核蛋白的表达层次(对照组:黑色虚线,R2 = 0.0506;Parkinson病的大脑:红色虚线,R2 = 0.9950;所有分析的大脑结合:黑线,R2 = 0.4369)。 请注意,PD的大脑表现出RNA的完整性之间有很强的负相关性,并检测到-突触核蛋白的表达层次(红色虚线,R2 = 0.9950)。 (六)平均A-SYN,TH和ENO2的表达水平显著高于个人新墨西哥州(+)从SN PD人脑DA能神经元与对照组相比(见表1和表2)。 发表于:核酸研究1-16(2008); DOI:10.1093/nar​​/gkn084,版权所有:牛津大学出版社。

 

 

在M.Parkinson研究未来的挑战

目前,没有测试诊断M.Parkinson在早期阶段,并且有本病的许多变种,并有类似症状的疾病。 因此M.Parkinson案件的一定比例被诊断错误或不能确诊的。

的前提,成功治疗 M.Parkinson将是有效的早期诊断。 如果这种疾病可能在哪些神经元是刚刚开始堕落的初始阶段被诊断,有可能防止进行性神经元变性,使疾病不打出来的。

在血液或脑脊液生物标志物的鉴定是目前的一大研究热点。 有基因并非只在脑中表达,但无所不在 - 在所有细胞中。 如果这些基因的表达中的一个分枝Parkinson情况下,多巴胺能神经元被改变,这将是可能的,研究更容易获得组织诊断的目的。 第一个步骤已经采取了,但还有很长的路要走,这样的测试才能实施,并进一步的长期研究需要进行。