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尼康显微镜在活细胞显微术焦点漂移矫正

2014-03-27  发布者:admin 

 直到80年代末,大多数生命科学研究人员通过捕获的各种细胞学特征单一的快照使用固定和染色(实际上,非生物)标本研究生物结构的复杂细节。在过去的几十年中,然而,研究在生物和医学科学已经在很大程度上转移重点调查了发生在生命系统的分子,细胞和整个生物体水平上的时间尺度范围从毫秒到小时浩大的动态过程。 此过渡到成像活细胞的司机已垫付的发展显微仪器,更灵敏的数码相机,以及新合成和基因编码的荧光基团,能够针对特定的细胞器,精度高。 因此,单次显微照片和固定的,死细胞数位影像时代使用宽合成的探针,量子点和荧光蛋白的光谱已经在很大程度上屈从于活细胞成像,其中重点在显微镜载物台上保持细胞长时间的时间是一个关键因素。

在透射光及荧光显微镜活细胞时移成像技术的应用越来越普遍也许是最好的,几乎出现在科学文献中,每天的研究报告数量浩繁证明。 在大多数情况下,细胞活性在专门为使用荧光探针技术联接到连续的图像捕获显微镜载物台设计的组织培养成像室监测。 先进的对比度增强技术,如微分干涉对比(DIC),相位对比,暗视野,荧光,和霍夫曼调制反差(HMC)可以采用用于记录的动态在宽的试样如以上冗长的时间周期连续序列的频谱。 同样的,更先进的荧光技术,包括激光扫描共聚焦,旋转盘,多光子,和全内反射(TIRF)显微镜越来越多地被用于随时间监测细胞内过程。

除了其在细胞生物学重要性,延时成像,也可用于研究多种液体样品和固体材料在化学,工业,和地质系统,以及液晶相转变和结构分析的光谱新的和先进材料金相。 在基础生命科学,时间推移成像(也称为cinemicrography)已被证明是一种有效的工具,调查粒子运动,分子间的相互作用,细胞迁移,细胞分裂,细胞器动力学,细胞凋亡,分化和神经生长过程中,其中一个许多新的和有前途的应用。 最近,在荧光蛋白质跨越整个可见光谱的发展革命已导致只能通过观察随着时间的推移进行调查动态无数细胞内事件的发现。

示于图1是一些在活细胞显微术用于延时成像更加有用和流行的对比度增强技术的例子。 在图1所示的粘合印度麂鹿皮肤成纤维细胞(一)进行成像在DIC的方式来可视化细胞骨架的应力纤维赘疣。 鼠袋鼠肾上皮细胞在图1中相位对比成像(PTK1线)(B)揭示了从中止细胞分裂而产生的双核细胞,而一个单独的人骨肉瘤(U2OS线)细胞的成功的分割捕捉与HMC中图1(c)。 这些强大的透射光技术被广泛用于时间推移活细胞成像。 同样,激光扫描荧光技术和旋转盘共聚焦显微镜(图1(d)中,DEOS荧光蛋白在中国仓鼠卵巢细胞;在HeLa细胞和图1(e)中,EGFP-标记的内质网)可被用于许多的观察,包括光活化,共振能量转移(FRET),光漂白技术,运动性,以及荧光蛋白分布的动力学。 全内反射荧光显微镜(TIRFM,图2(f)中示出的mCherry荧光蛋白融合到纽蛋白在狐肺成纤维细胞)是用来观察发生在靠近盖玻片细胞膜的事件。

在时间推移成像的历史透视

时间推移成像在活细胞中的首次应用是由一个年轻的法国研究生谁正在检查活动力梅毒螺旋体生产报在100多年前(大约五年前卓别林做了他的第一部电影)。 学生,让Comandon,用一个巨大的电影胶片相机连接到一个更小的暗视野显微镜,期间一个复杂的配置捕获的图像序列,但认为很粗糙的现代标准。 在后二十世纪上半叶,时间推移图像序列采用紧凑型16毫米相机上配备相衬照明显微镜通常记录。 连续的图像捕获之间的时间间隔是由粗大的辅助intervalometers,该装置把灯打开和关闭图像之间,为了避免试样的过度照射和加热控制。用于电子显微镜光源百叶窗没有市售,直到20世纪80年代。

依靠胶片相机的早期时间推移成像技术是受到众多陷阱。 最重要的,这部电影不得不被发送出去(在大多数情况下)为商业处理,这意味着实验结果的评估可以通过几天甚至几个星期被推迟。 此外,使用薄膜是昂贵的和受主的,通常导致不一致的结果的处理的变化。 例如,暴露的错误可能不会发现,直到周的实验已经结束后,和焦点漂移的共同问题是往往无法检测,直到处理膜被查看。 虽然许多随时间推移成像相关的文物,如焦点漂移,样品不均匀加热和震动,仍采用现代数码相机的时候妨碍最终结果,该技术已显著成熟,在过去的十年。(本文来源:尼康显微镜在活细胞显微术焦点漂移矫正

发生在时间推移cinemicrography的第一次重大进步,当视频管摄像机和图像采集卡电脑卡终于与显微镜结合,开始在20世纪70年代。 虽然由视频摄像机产生的图像中较低的分辨率比传统的基于乳液的膜,大约与胶片摄像机相关联的曝光设置的不确定性都大大减少。 作为一个额外的好处,对图像序列可以采集过程中进行查看,并立即供审查和编辑使用录像带输出延长时间推移实验的结果。 相比之下,耦合到一个磁带录音机摄像机的成本是显著小于胶片电影摄影机,当膜处理的费用被认为是。 对于录像带与电影的重复费用也少得多,而且含有不良序列磁带可以被擦除或覆盖,并置于重新投入生产。

活细胞动力学的一个例子是使用photoconvertible 光学荧光笔荧光蛋白标记的线粒体示于图2。 试样是一种附着兔肾上皮细胞培养物(RK-13 ​​行)表达融合的红-绿photoconvertable DEOS荧光蛋白到线粒体靶向肽序列。 当与488纳米的激光照射,丰富的绿色荧光线粒体整个细胞质中(图2(a))的观察。 位于长filopodium单个线粒体是使用从在第一帧中的405纳米激光的简要脉冲光转换。 新红色荧光的细胞器是一个20分钟的间隔后捕获为未转换的线粒体途径(图2(b))。 片段化后,将未转化的线粒体使一个接近的方法来光转换邻居(图2(c)),并且这两个线粒体随后保险丝(图2(d))与细胞器之间分布的光转换荧光蛋白标记。 第二碎片事件(图2(e))后,将光转换线粒体的一小部分接近第二未转化的线粒体,但不是熔化,形成了一个环形(图2(f))。 在图2所示的帧由包含在2小时内收集到超过1000图像的时移序列被选定。

尽管越来越多的研究正在成为使用荧光蛋白参与了活细胞时移序列采集,数字静像继续被广泛地用于在延长的时间周期记录在细胞培养物中的动态事件。 在许多情况下,间歇性单图像可以以更高的分辨率使用照明水平大于都是可行的串行延时成像捕获的具有改进的信号与噪声。然而,在计算机体系结构和数据存储容量技术的迅速发展也助推延时cinemicrography到复杂的一个新的水平。 在主内存,快速缓存,处理器速度和硬盘容量上一个局限被克服,使包含数千帧的组成和几个GB复杂的图像序列,可以在本地存储主机上。 硬件的进步已通过并联可控制几乎所有方面的高速图像采集,包括载物台运动,光照强度,曝光时间(和其他的相机参数),辅助的光学元件(如放置DIC棱镜在新的和复杂的软件程序包光路)和波长。 最先进的软件也可以进行采集后图像处理,增强的视频功能。 在简单的系统中,介质的性能的计算机可使用通过一些接口来控制一个科学级的数码相机。

在专门的荧光显微镜技术,包括激光扫描共聚焦,旋转盘,TIRF和多光子耦合到新兴的电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)技术,使科学家能够观察广,利用新开发的荧光动力学事件的频谱现代进步探头针对特定的细胞区室,生物分子和受体蛋白。 通过采用这种先进的方法,多个事件可以同时记录在四个或更多个尺寸(横向,轴向,在时间上和光谱上)提供一种非侵入性的窗口进入细胞内的活性在一定时间范围内选定。 此外,活细胞成像技术已经在帮助领导革命目前在细胞生物学,这是提供具有空间和时间信息的科学家,这是以前没有的。

焦点漂移的起源

尽管有各种​​各样的,在过去​​的几年里已经发生了光学显微镜的技术进步,通过缓慢的变化表现为标本聚焦在时间推移成像过程中的轴向波动仍然是一个显著的问题。 术语焦点的漂移通常是用来描述一个显微镜无法维持所选择的焦平面在一段较长的时间。 分别发生在活标本的自然运动的这件神器,主要受一些影响因素,下面列出。 一般情况下,采用高放大倍率和数值孔径油浸物镜时(有重点的非常浅的景深)比它更低的放大倍率(10倍和20倍),与更广泛的震源深度物镜,重点漂移是更多的问题。

  • 热漂移 -温度的变化也许是焦点漂移的最常见来源。 波动温度所产生的空调和中央供热单位在实验室中的结果,在显微镜激烈的照明光源,以及加热不均的物镜和阶段通常是在焦点漂移的主要元凶。 此外,不同的膨胀和收缩率的材料用于构成培养腔室和/或光学显微镜列车可导致距离的物镜前透镜与盖玻片之间的变化,从而导致聚焦的损失。 具有最高倍率物镜,只需1度的变化通常足以产生0.5至1.0微米的焦平面偏移。

  • 盖玻片的Flex -热梯度和在培养室的温度等变化,以及与灌注期间迫使流体通过所述成像室相关联的工件,可以制作隔膜作用在该标本弹离焦的盖玻片弯曲。 这神器往往是显而易见的内庭,其中灌注系统控制​​不佳。 盖玻片弯曲可能不会在图像捕获序列可以灌注会话之间是交错的情况下,呈现显著的问题,但它会严重影响那些需要较高的时间分辨率(2秒或更少)的研究。 盖玻片挠曲可以通过减少在流动室的灌注输入口的直径,并通过装备在显微镜用物镜加热器以补偿腔室的温度波动最小化。 小,但可再现的,在盖玻片的运动也可以发生在培养室,均设有导电性,透明涂层,以维持温度。 在这种情况下,施加的电流负载,以涂布的盖玻片上可以产生收缩或暂时打乱焦点扩展。 正确的焦平面通常将重新建立一次电流负载被删除。

  • 成像室加热的不均匀性 -活细胞成像腔室产生的各种各样的配置,往往利用完全不同的技术用于保持试样在恒定温度。 例如,腔室具有被加热的导电涂层(图3(a))的盖玻片往往产生在整个玻璃表面优异的导热一致性比这样做只加热周围的盖玻片的周围的金属腔。 在后者的情况下的热梯度可以很大(图3(b))。 此外,高的数值孔径的油或水浸物镜可以作为一个散热器,以传导热量远离所述试样腔室和进金属物镜,这样就产生在液浸介质中的区域中的热梯度。 其他文物,如从电源并在室温显著波动电流的变化也可以负责在样品室加热违规行为。

  • 振动 -一种常见的神器与众多的起源,振动往往是由多种与仪器配置有关,此外就是出现在周围的环境资源要素的生产。 在显微镜及配件,过滤器车轮,百叶窗,自动阶段,过滤器的炮塔,和零部件等机电运动是振动与稳定的重点干扰的常见原因。常见的外部(非显微镜)的振动源是空气处理系统,步行交通,冰箱压缩机,电梯,并且成像设置近重型设备的议案。 隔离表,减震垫,以及台式平台上,可从各种各样的分销商的,是有用的,以减少振动。

  • 机械不稳定性 -满载物镜的一个物镜转换器可以在3和5英镑,这往往代表对涉及显微镜对焦机构的机械组件的显著重力应变之间的权衡。 其结果是,聚焦偏移的发生原因只是由于重力对物镜转换器的拉力。 此神器可以只使用一个单一的物镜来记录时间推移录像可以减轻到一定程度。 此外,明智的做法是确保(如果可能),该显微镜配备有具有短长度的机械精密聚焦系统,并维持聚焦张力控制的适当的设置。机械不稳定性的其他来源包括松散的齿轮组中的焦点机架或聚光镜支柱,以及作为辅助成分。

  • 浸没介质波动 -在高分辨率活细胞研究,用于延时实验的显微镜物镜可能需要包括油,水或甘油浸入介质。 在过去的收集到足够的数据,粘度波动和成像介质的化学分解所需的时间太久,会影响性能和浸泡媒体的传播。 浸油的粘度和折射率通常随温度变化和水很容易蒸发,必须考虑和监测,以避免焦点漂移的因素。 新开发的高性能有机精油,可在大范围内的折射率(包括等同于水和甘油值),并提供了一​​个很好的解决方案,以使用传统的浸入式媒体。 在某些情况下(取决于成像室配置),一个垫圈或套管可被用于形成物镜和盖玻片,以减少水蒸发的水平之间的密封。

  • 加入试剂 -许多研究需要的培养基或添加化学试剂时延时成像序列变化。 导入试剂到培养室的物理行为可以产生机械冲击,这将导致在焦点漂移和添加试剂不属于在同一温度作为成像介质可以产生类似的效果。 在加热的灌注系统,引入新的媒体或化学品通常产生微不足道的变化的轴向聚焦平面,但用移液管或注射器中加入液体以一个开放的腔室可以扰乱焦点。

  • 横向运动阶段 -在某些情况下,房间的温度波动或振动将产生一个小的横向-机械阶段,(在某些情况下)会导致轴向集中的漂移(x和y)的翻译。 这通常是一个微不足道的问题,但可以成为严重如果一个开放导管的显微镜直接推动冷或暖空气。 如果该阶段配备一个夹具,它应该起延时成像之前被启用,但在其他方面也有一些补救措施。 采用步进电机先进的显微镜阶段一般不受到横向移动文物。

  • 不安全的样品室 -试样成像室的延时序列中移动会导致焦点漂移由于盖玻片的新位置。 在固定玻璃底培养皿在载物台光圈阶段适配器,改变菜的位置可发生弯曲钳或机械构件,如干扰电线及气/液管连接室控制器和其他的结果辅助元件。 此外,多井成像室往往从轻微变化放置时蒙受单独盖玻片连接到每个孔中,从而在扫描板聚焦误差。 室运动和盖玻片高度不一致是必须定期解决一个共同的神器。

  • 标本运动 -在活细胞成像的一个不可避免的神器是试样的运动远离显微镜焦平面。这通常使用正处于有丝分裂,其中的细胞显着改变形状的中期贴壁细胞采集时间推移顺序发生时。 在其他情况下,试样可以完全移出视场的,无论是通过从盖玻片分离或通过蠕动。 除了使用凝胶和试剂,如纤连蛋白锚定的细胞和组织的盖玻片,没有机械,化学,或对检体的运动的电气补偿。

解决方案聚焦漂移

许多年来,用于校正焦点偏移的最佳解决方案是站,以便提供一个学生或技术员在显微镜近手动重新聚焦在必要时。不幸的是,这是绝对不适合长期成像实验相对成本过高以及基本无效的解决方案。焦点漂移的问题已经通过各种渠道,包括软件算法,专用显微镜硬件,抗振动垫和表格,并封闭在保护环境的显微镜(如图4)中得到解决。这些方法都得到不同程度的成功,但都没有提供,可以扩展到几乎所有的活细胞成像场景焦点漂移的通用解决方案。

热不稳定性,这也许就是焦点漂移的最显著源,可以在很大程度上是与大型有机玻璃外壳(称为消除环境试验箱 ;图4(c)),从外部环境隔离的显微镜,并提供了良好的条件,促进登录相位细胞的生长。培养箱式外壳包围显微镜载物台,物镜,荧光过滤器,以及透射光聚光,几乎涵盖整个显微镜以及试样。这些室可用于各种培养容器,包括标准培养瓶,培养皿,载玻片与盖玻片安装及各种开式和闭式成像室的。温度保持与外部加热装置(通常是强迫空气)和二氧化碳浓度被控制与耦合到由纯气体的气瓶供给的调节器的感测单元。

环境试验箱还可以配备湿度控制及多种设计提供橡胶手套的访问,以避免在成像过程中操纵细胞,当干扰环境的平衡。为了保持温度控制程度高,避免焦点漂移,几个比较成熟的孵化室括几乎整个显微镜除外目镜,摄像头,并lamphouses的。在缺点方面,环境试验箱可以阻碍快速获取标本,并在繁琐重复操作是必要的。此外,该室内部的高湿度水平可以添加到保持在仪器由于齿轮润滑剂的过早降解和金属表面和透镜涂料氧化的费用。作为替代,其耦合到阶段顶孵化物镜加热器可以被使用,但这些装置并不总是与具有保护桶,很难除去浸泡物镜兼容。

在过去的几十年中,众多软件算法已被设计来解决焦点漂移基于对比度或边缘检测。 许多这些最终被纳入科学成像软件包设计也处理图像并控制显微镜。 焦点漂移的软件控制需要被配备有数码相机和计算机控制下的电动物镜转换器的显微镜。 通常情况下,重点调查基于软件的显微镜需要两个互补的算法来实现聚焦控制。 第一确定了物镜的轴向(z)的位置和真实的焦点之间的对应。 第二个是一个搜索算法(图5),通过捕获图像样本的焦平面,以确定最大焦点“得分”的位置(最佳位置)。 大部分的重点软件控制开发的算法有,但是,在使用静态的标本具有稳定的几何结构创建和当时间推移调查适用于动态活细胞是远不如有效。 此外,该算法通常用于特定照明场景(明场,相衬等)进行优化,并在应用到对比度增强技术(如荧光),用于它们的目的不是可能失败。

重点软件算法通常依赖于一个良好的聚焦图像包含比失焦图像对比度更高或更精细的细节(实际上,更高的频率)的事实。 作为一个例子,采用了拉普拉斯算子来估计焦点时,该算法计算出一个采样图像的二阶空间导数,移动物镜向上或向下通过一个预先确定的量,然后重复该过程,直到最佳拟合被确定。 在分析过程中越来越小的步骤通常采取在两个方向上。 从过滤器高输出值表明大强度变化的区域,通常在图像内表示的边缘。 在任何图像,最高的频率成分发生在边缘,应该是最突出的特点,当试样最佳聚焦。 为重点漂移,边缘模糊,产生在图像下二阶导数。 采样反复进行,直至最合适的判定。 通常,这可能需要几分钟,这遇事推诿的软件例程的重点只需要使用图像采集间隔期长的延时实验。

在共聚焦时间推移显微镜,其中每幅图像保持清晰的对焦不论仪器是否正在经历轴向偏移,聚焦校正可以通过定期收集从样品的一系列Z-堆栈(光学部分),不论厚度来实现。 单个堆叠然后分析使用软件来确定在Z堆叠并且记录在该序列的开头的参考图像中的每个图像之间的Pearson相关系数。 堆栈分析后,具有像素强度的最大相关系数的图像是用来识别正确的聚焦平面(对应于基准图像的平面)。 协同定位信息可以被用来复位物镜的焦平面。 虽然这种技术应该工作得非常好提供的软件和硬件接口正确,目前还没有商业应用。

从理论上讲,使用软件算法上的荧光标本应因明亮的荧光结构和黑暗的背景之间有极强的对比度产生极好的效果。 然而在实践中,基于软件的补偿技术要求是基于几个图像的荧光物种,从而导致光漂白和光毒性被加重与试样的每个暴露于光效果的捕获的计算。 此外,该算法是使用能产生清晰的聚焦光学部分,无论轴向焦点位置(如共聚焦,多光子,与DIC)的文书确定的重点几乎无用。 使用软件时,保持焦点另一个缺陷是,该算法往往能决定一个最佳的焦平面是从选定的时间推移序列的开始的初始平面不同。 当在软件焦点判定的算法组合使用荧光​​,另一种是执行用试验片的透射光图像的焦点分析步骤。 然而,这需要机械快门的应用两个荧光和透射光路,可引入附加的振动。

如图6中所示要么是没有任何焦点的漂移校正(图6(a),6(b)和图6(c))或具有基于硬件的焦点维护系统,如下面讨论的(图2进行时移序列图6(d),6(e)和6(f)段)。 该标本是狐狸肺的文化(FoLu线)表达融合mPlum荧光蛋白和靶向序列产生明亮荧光的细胞器线粒体成纤维细胞。 图像聚集在组合荧光和DIC的模式在一段7小时共聚焦显微镜工作在30秒的时间间隔。 如果没有自动对焦系统,在显微镜很快失去焦点,就证明了荧光强度的图6的连续亏损(b)和图6(c),其中发生在不到45分钟。 与此相反,硬件自动对焦管理(通过图6(六)图6(d))为整个调查产生清晰,重点突出的图像。

聚焦漂移补偿系统

多年来,已经开发出了一系列旨在弥补焦点漂移的基于硬件的解决方案。 在大多数情况下,这些设备试图测量,以保持试样在焦点对长时间的目的和样品支架或台之间的距离。 例如,附连到显微镜物镜转换器的涡流传感器的设计是由1发明人来监视距离,以使用DC马达耦合到所述聚焦机构的阶段和正确的波动。 另一种技术采用的试样保持器和连接到该物镜,以提供用于支撑试样夹持器的压电元件的误差信号的套环之间的距离依赖性的电容的优点。 第三,更复杂的方法依赖于将一个全息光栅在物镜瞳孔保持标本的焦点。 专门的光栅产生由独立的传感器检测,以产生聚焦校正信号的两个散焦的一阶图像。 最后,一​​个前体到现代的硬件解决方案的结合在背反射被引导到一个小的棱镜置于光学火车和监视用双光电二极管阵列,离轴氦 - 氖激光束的焦点依赖性变化。 在焦点自发漂移被检测为一个非零差分信号,然后被用于驱动一个简单的马达连接到所述细焦点的机制。 虽然这些硬件焦点补偿方案是成功的程度不同,没有看到在商业显微镜系统的责任。

作为一个通用的方法来提高显微镜焦点的稳定性,各厂商纷纷花费相当大的精力来产生的工程改进,降低了重心偏移到最低限度。 例如,几个嵌入式机械系统(重点组件,百叶窗,电动平台,炮塔旋转)进行了改进和问题的重型物镜得到解决。 仪器的帧正在制作与专门的合金能够抵抗热膨胀,而辅助部件,如鼻甲正在与耐热的聚合物制成。 这样的改进已经加上先进的线性编码器,它是电动的组件,可以重新定位阶段或物镜转换器的精确位置用比50纳米的精度。 尽管这些改进已导致高级显微镜,可以一个或2微米内保持聚焦更长的时间内,它们仍然一直无法克服的事实,加热样品室(和其相关联的盖玻片)受到热膨胀和收缩,通往回到原来的焦点漂移的问题。

为了解决固有的几乎所有盖玻片为基础的成像腔热漂移的文物,在显微镜和售后市场的制造商最近推出了新的硬件解决方案,通过采用几种稍有不同,但仍密切相关的方法来弥补焦点漂移。 要注意的重要一点是,与浸没物镜,大多数这些装置的操作基于这样的假设下观察和盖玻片的水性表面的试样之间的关系是固定的(因此,该细胞或组织薄不自由浮动在培养液中)。 相反,细胞或组织(如黑腹果蝇卵室)或者是自然附着在玻璃或附加到通过薄的层粘连蛋白,纤连蛋白,多聚赖氨酸,或糖蛋白的盖玻片。 所有市售系统的定位的上外部盖玻片表面,通过测量由弱近红外线激光或发光二极管(LED发出的反射光的形状的线图案的位置(玻璃和组织培养基或缓冲液之间的界面);如示于图7)。 相反,对于干物镜,光从下部盖玻片表面(与空气接触)的反射被用来确定样品是否在焦点上。

该图在图7中的图表呈现的重点漂移补偿系统如何能够利用光的反射的优势从盖玻片来衡量的相对焦点位置。 的试样中的感兴趣区域是用于由操作者来设定初始从盖玻片上表面,其中确定焦平面,并作为基础补偿(图7(a))的偏移量。 当焦点发生漂移(在此,作为盖玻片更接近物镜的轴向运动的结果,图7(b)),激光二极管或反射从盖玻片的检测强度为重新定位物镜和恢复所需的信息的偏移补偿。 因此,电动轴向聚焦单元接收反馈的补偿制度,以纠正在盖玻片检测到的漂移,然后恢复偏移预定义的轴向值,样品(图7(c)和7(D提供清晰聚焦) )。 注意,试样本身不参与焦点校正,而通过反射在玻璃 - 水界面产生的干涉图案控制这些设备。

总之,解决焦点漂移的问题也许是发生在最近的历史是活细胞成像的最显著进步。此工件必须总是设计为延时成像和更为明显使用高数值孔径物镜,其中聚焦的窄深度可以很容易地与丝毫振动移位或改变温度时的实验系统的结构中加以解决。焦点漂移也是一个关键因素(还有一个相当大的挑战)在每个时间间隔成像单个样本中的横向和轴向位置的复杂序列时消除。在大多数情况下,新的焦点漂移补偿可以从显微镜制造系统能够以不同的速度的情况下提供优异的校正,虽然。不管复杂的仪器水平,然而,进行延时实验与活细胞时,必须密切关注支付给上述漂移因素,包括热环境,标本成像室,振动,浸入式媒体,稳定性和机械稳定性。一旦所有的基本细节已经解决,谨慎的调查人员应给予奖励以优异的成绩。



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