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徕卡显微镜怎么脱钙?

2014-03-25  发布者:admin 

 脱钙描述的技术中用于除去从骨或其它组织钙化矿物,使优质的石蜡切片,可以制备将保留所有必需的微观元素。 脱钙进行后标本已被彻底固定和前常规处理石蜡。 在本文中骨的基本结构进行说明,并在技术选择用于制备章节中所述。 对于脱钙和成功地监测该过程的程序进行了讨论,并提供了一​​些流行的选择试剂的选择。

介绍

有一些当组织学家是必需的,以产生从骨或其它钙化标本切片可用的选项。 在选择技术和加工方法必须考虑到调查正在开展的类型。 例如,如果骨代谢病已在调查中,必须从骨样分化矿化骨,或者如果形态学测量是必需的,它可能有必要通过产生的“非脱钙”骨部分,以保持和展示的矿物质含量。 作为矿化骨是这样的硬质材料也有提供由它产生的部分的技术范围有限。 固定后,它可以直接锯成薄晶片,然后利用研磨磨料的表面,以产生薄的“接地”部分(参见图1)。 另外,也可以通过与丙烯酸或环氧树脂的聚合时,具有同等的矿化骨的硬度渗入他们准备骨标本。 然后,您可以从他们身上直接使用重型切片机(如徕卡SM2500)和碳化钨或金刚石刀具(见图2)的渗透标本或部分产生接地部分。 矿化松质骨的冰冻切片是另一种可能性。

图1:密质骨的未染色的地面部分。 许多骨单位(哈弗系统)被横向切割。 该骨单位由骨(lamelle)的周边包含血管的中央哈佛氏管同心层。 内lamelle是空白(空格)通常含有骨细胞。在干燥的地面部分,如这一点,他们会显示为黑色结构,由于颗粒磨料和包含在其中的空气。 
图2:松质骨(冯·科萨)的非脱钙部分。 骨固定在福尔马林中,并进行处理和嵌入在环氧树脂用于切片。 钙化骨是黑色的,因为是骨髓的部件类骨质的骨小梁的表面上的边缘被染成蓝色。 需要注意的是,尽管聚合的树脂的支持下,在这种情况下,基质钙化已经准备的一段期间破裂。
 

更常见的骨和其他钙化标本脱钙(软化水)以下的固定,并用标准方法产生的石蜡切片进行处理。 脱钙切片用于骨髓的检查及肿瘤,感染或用于其它目的的诊断。 试样可在髂嵴环钻或骨片在操作(如股骨头)除去或从截肢标本解剖的表格。 精细的细节X光片通常用来协助适当骨标本进行处理的选择。 除了 ​​在骨,其他组织可能经历与变性过程如坏死(营养不良性钙化)相关联的钙化或它可能发生在血管壁或在肾,肺或其他地方(转移性钙化)。 如果钙化区域中组织标本是巨大的,可能无法获得体面部分而不先脱钙标本。 另一种可能性,是采用“表面脱钙”的石蜡块,以便在那里不被预期的,当试样加工钙的存在下,获得的部分。

脱钙程序比较简单,在组织学技术的标准文本被广泛地讨论。如果高品质的结果不过是要得到,有些点是值得重视的。

骨的结构

骨骼是由含有1型胶原纤维钙化基质包围细胞(骨)的。 在基体中的钙是在羟基磷灰石结晶形式的[Ca 10(PO 4)6(OH)2]这是纤维状元件之间沉积。 这些晶体脱钙的过程中,如果正确地执行,叶凝聚力组织致密纤维结缔组织的物理特性中被溶解掉了。

有两种类型的成熟骨的。 皮质或密质骨形成长骨和头骨的扁骨的主要部分的轴和具有基于所谓的骨单位圆柱形结构(图3)的结构的非常致密的结构。 松质骨,骨小梁或骨松质有一个更加细致的安排,由薄薄的隔板(小梁)连接骨板之间找到了骨髓。 它位于脊椎和长骨的骨骺(图4)。 既紧凑和松质骨发育中的层或lamelle,其中胶原纤维在结构上定向,并显示根据偏振光显微镜的特征的图像(参见图5)。 

图3:从长骨用甲酸(H&E)最佳脱钙的横截面。许多骨单位与外围水泥线被示出。 以及染骨细胞的细胞核都存在,表明脱钙终点是不超标。 
图4:松质骨的长骨(H&E)的一个骨骺部分脱钙(粉红色)和透明软骨(蓝色)。 骨的骨小梁细腻保存完好的是骨髓和脂肪细胞相关的精细结构。 色斑的嗜碱性/嗜酸性平衡良好的维护指示甲酸脱钙是最佳的。 
图5:密质骨的长骨(H&E)的轴上的脱钙部分。本节是在偏振光下拍摄以展示同心lamelle形成骨单位。 双折射是由于胶原纤维在骨基质的连续层之间的不同的方位。
 

仔细考虑接收到的用于处理任何骨样品的性质是很重要的,因为皮质和骨松质的相对量是很重要的,并会确定所需的脱钙和处理的时间。 例如,髂嵴环钻标本由皮质骨的边缘覆盖的松质骨的圆柱体。 皮质骨将是最后脱钙过程中放弃其钙盐除非它是完全脱钙难度将会经历获得体面的部分。

骨的固定

为了保护骨细胞和纤维元件所造成的作为脱钙剂的酸的损害,这是特别重要的,以彻底解决这些标本之前脱钙。 脱钙期间较差固定的标本成为浸渍和染色之后不佳。 这是非常明显的含骨髓领域。 因此,通常的做法是对实验室固定时间为骨骼标本脱钙开始前延长 。 它提供随时为固定液穿透骨头是很重要的,所以皮肤和软组织应该从大样本,如果可行的去除。 骨标本应尽快以提高固定和固定剂的适当量提供锯成薄片。 高质量的细齿锯应该用来制备骨片。 粗锯可引起相当大的机械损坏,并迫使骨碎片进入存在于试样中的软组织(参见图6)。

福尔马林缓冲液是用于骨令人满意的固定液但其中一些实验室将使用替代品,如1的锌福尔马林的混合物,B5,甲醛乙醇(Davidson的固定剂),或布安骨髓的保存是很重要的。

图6:环钻标本中骨碎片已在筹备(箭头)被强制进入骨髓的空间。 这是沾上冯·科萨的方法来证明钙的未脱钙树脂部分。
 

脱钙代理 - 概述

主要有三种类型的脱钙代理:

  • 那些基于强无机酸
  • 那些基于弱有机酸
  • 那些组成的螯合剂 。

为了方便大多数实验室选择从现有的许多专有试剂。 这些产品的潜在用户应咨询相关的MSDS,以确定活性成分存在,如果它没有明确提供的技术资料说明。

脱钙代理 - 强酸

强酸如盐酸或硝酸的浓度高达10%是最快速的动作,但如果使用过多的时间会迅速引起核染色的损失,并且可以浸软组织中。 重要的是,适当的终点试验用于减少标本对这些药物的暴露。 一般来说专有decalcifiers自称是迅速行动即根据强酸,最常用的盐酸,并应谨慎使用,注重提供的说明书,如果效果不错,来获得。 例如Surgipath的Decalcifier II®是迅速的行动,并含有盐酸。 图7展示了用无机酸decalcifier超出适当端点延长治疗的后果。

表1列出了一些比较常见的无机酸为基础的decalcifiers的。 histotechnology的标准教科书应征询一个更全面的列表。

表1:矿物酸decalcifiers 

Decalcifier

公式

评论

硝酸

5%在蒸馏水中

迅速行动,超过终点会损害染色。

Perenyi的流体 (1882)

10%的硝酸40毫升

0.5%铬酸30毫升

无水酒精30毫升

传统decalcifier的decalcifies比硝酸水溶液更慢。 在行动相当迅速,超过了终点会损害染色。

盐酸

在蒸馏水中的5-10%的

福尔马林应该从标本放置在HCl避免双 - 氯甲基醚(一种致癌物质)的形成前要洗净。 迅速行动,超过终点会损害染色。

冯埃布的解决方案

饱和氯化钠的溶液。 50毫升

蒸馏水42毫升

盐酸8毫升

迅速行动,超过终点会损害染色。

图7:脱钙松质骨(H&E)的一个部分。 对该样品进行脱钙用盐酸decalcifier为过多的时间,而无需使用一个适当的端点检测。 虽然组织要素是凝聚力的染色非常差,显示具有较强的,低分化曙红起来完全没有核染色。
 

脱钙代理 - 弱酸

弱酸,例如甲酸很受欢迎,被广泛用于脱钙。 甲酸可以用作简单的10%水溶液,或与福尔马林或用缓冲。 虽然它比强酸剂慢它是在动作更加温和,不太可能干扰核染色。 1,7基于甲酸的专有decalcifier的一个例子是Surgipath的Decalcifier予®。 它还含有甲醛,并声称修复以及脱钙和温柔的动作。 其它酸如三氯乙酸(TCA)也被使用。 苦味酸,如一些固定剂的一个组分具有弱脱钙特性。 

表2:弱酸decalcifiers 

Decalcifier

公式

评论

甲酸

在蒸馏水中的10%的

一个简单有效的decalcifier。

埃文斯和Krajian

甲酸25毫升

柠檬酸纳10g

蒸馏水75毫升

一个有效的甲酸decalcifier缓冲柠檬酸。

克里斯腾森

甲酸18毫升

甲酸钠3.5克

蒸馏水82毫升

一个有效的甲酸decalcifier缓冲甲酸

古丁和斯图尔特

甲酸5 - 25毫升

40%的甲醛5毫升

蒸馏水75毫升

甲酸decalcifier添加了福尔马林,声称固​​定和脱钙。

脱钙剂 - 螯合剂

通过从磷灰石晶体的表面捕获的钙离子,慢慢地减少其大小,螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA),工作。因为这个过程是十分缓慢的,但很温和(周可能取决于样品的大小被要求),该试剂不适合于紧急标本,但更适合于研究应用中的质量非常高的形态是必需的或特定分子的元素必须是保存诸如IHC,FISH或PCR技术。 这是用在大约14%的浓度作为中和的溶液。在其中将EDTA脱钙率是pH依赖性的。 它通常用于在pH值7.0。 它可以更迅速地在pH为10,但有些组织元素可以在碱性pH下被损坏。

 

表3:螯合剂

Decalcifier

公式

评论

中性EDTA

乙二胺四乙酸二钠盐250克

蒸馏水1750毫升

加入氢氧化钠使pH值至7.0(约25克将需​​要)。

徒缓慢而引起组织损伤小。 传统的污渍基本上不受影响。

影响脱钙率的因素

浓度。 
活性剂的浓度将影响在其中钙被去除的速率。 发表制剂脱钙溶液在速度和组织损伤的程度之间的平衡。它必须记住,活性剂的浓度将被耗尽,因为它结合了钙,所以它是明智的,使用大容量decalcifier和在脱钙过程中更新了好几遍。

温度。 
温度升高会加快脱钙率反而会增加组织损伤率等都必须非常谨慎地使用。

激越。 
轻轻摇动可能增加的速度咯。

流体的访问。 
与固定新鲜decalcifier应可随时到试样的所有表面。 这将增强扩散和渗透到标本,并促进解决方案,电离和去除钙。

其它技术用于增加脱钙的效率

用EDTA使用超声已被成功地用于加快环钻标本脱钙用于后续的分子分析。 在这个过程中的温度必须小心地控制。 微波治疗已被用于与盐酸decalcifiers但升高的温度可能会损坏形态和染色造成假象。离子交换树脂已被纳入一些脱钙协议。 它们被加入到容器保持decalcifier和占用的离子钙维持酸的有效性。 如果酸decalcifiers中使用适当的数量及定期更换使用这些树脂的可能是不必要的。电解脱钙,其中骨被放置在酸decalcifier并连接到通过其电流施加用电极是一个还没有得到广泛的技术接受,因为造成热损伤试样的潜力。

确定终点脱钙

如果高品质的结果是要得到以确定在其中所有的钙已经被去除的点是很重要的,因为,从此时起,组织损伤似乎发生的速度越来越快。 过度脱钙,特别是与强酸decalcifiers,败坏嗜碱性元素如细胞核的染色和在某些情况下可导致较软的组织元素的浸渍。 在另一方面标本是不完全脱钙可能很难或不可能一节。

最好的方法,特别是具有大的标本如股骨头,是对X-射线的试样。 一个好的品质的X射线会清楚地揭示微小残余的钙沉积,并允许进一步的治疗,如果必要的。 它是用于以下的大型试样如股骨头脱钙的过程(参见图8)的极好方法。 一个简单的化学测试时可以有些酸decalcifiers被使用(尤其是甲酸)被应用。 草酸铵溶液加入到脱钙的最终变化,已用氢氧化铵中的样品。 1如果钙存在草酸钙沉淀会形成表明脱钙可能是不完整的,并在脱钙较长的时间是必需的。 当然这个测试是最好在比较近decalcifier的变化(暴露于组织为比如,仅一小时)。 物理测试需要操纵,弯曲进行探测或修整试样的“感觉”剩余钙化区域。 虽然这种方法可能是成功经验的手中它通常被认为是不可靠的。 机械损伤可发生弯曲或探测和钙的小额存款很容易被错过时。 7通过仔细权衡标本漂洗和印迹也被描述后,确定端点的方法。 这可能是一种有效的方法对大样本。(本文来源:徕卡显微镜怎么脱钙?

 

如果您认为脱钙终点靠近,你想慢下来的过程,以避免过度脱钙和随之而来的组织损伤,如可能出现这种情况时,您的实验室在周末是没人住,标本可以从decalcifier被删除,漂洗并放回福尔马林(如果正在使用盐酸重要)。 脱钙可以被恢复时,方便。另一种方法是冷藏的样品在其decalcifier放慢进程4˚C。 1

图8:一种X射线系列继股骨头脱钙与甲酸/柠檬酸decalcifier的过程。 X线片均采用惠普Faxitron生产®和允许精确地遵循过程和终点,以得到正确的识别。 
图9:腓骨的脱钙石蜡切片(H&E)。 注试件的尺寸。 使用化学端点测试再加工使用扩展的时间表石蜡有人脱钙与甲酸剂。 13 Y /,男性持续他的右腓骨的病理性骨折跌倒后。 X线片显示为(R)腓骨中间轴的骨性膨大。 病理诊断为骨囊肿病理性骨折。 本节准备在病理学武力学院(美国)在1983年的骨实验室。
 

治疗下列脱钙和前处理

各种方法用于中和残余酸decalcifier处理之前已经公布,包括在自来水充分洗涤或碱性溶液中的应用。 通常很短,有效洗涤自来水中,应足以为任何剩余的酸处理过程中会被去除。它以除去大部分的decalcifier的,以避免污染的处理剂和用酸的处理器是非常重要的。

选择一个合适的时间表脱钙骨或其他组织脱钙

一旦矿物已被删除的标准处理进度表可以被使用。 它必须牢记的是,尽管完全脱钙,骨,尤其是密质骨,将包含需要彻底的处理密集的地区。 这是更好地使用时间表,太长不是太短。 您的选择将取决于样品的性质和大小。 真空中渗蜡的应用程序应该提高成品块的质量。

表面脱钙

这是与钙的小意外存款可在石蜡块中遇到的处理(参见图10)的方法。 一般而言,这是修剪块切片揭露了钙被发现的标本后。 重要的是在这一阶段,以尽量避免广泛地破坏块的表面上。 后的组织已经暴露块可以从切片除去并面朝下放置在酸decalcifier为15 - 60分钟。 这种表面处理将使decalcifier穿透小的距离成块,并溶解钙。 该块可以再在清水中彻底冲洗,以除去残留的酸,冷冻和切片。 块的仔细调整将被要求,因为decalcifier会渗透非常小的距离成块,允许采取只有几部分组成。

图10:从在意料之外的钙沉积遇到肉芽肿标本(蓝色)A节。 如果表面脱钙已应用于该块质量较好的部分本来准备。
 

 

结论

脱钙是一个简单的过程,但要取得成功,需要:

  • 标本仔细初步评估
  • 彻底固定
  • 合理的厚度为固定和处理芯片的制备
  • 合适的decalcifier有足够量的选择,定期更换
  • 仔细确定端点
  • 使用合适的时间表彻底的处理。