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尼康显微镜样品制备和成像

2014-03-21  发布者:admin 

 该程序在共聚焦显微镜制作和成像标本主要来自那些已经发展了许多年的传统的宽视场显微镜用途。 在开发一个新的协议为样本,以与激光共聚焦显微镜成像最好的方法是开始与一个已知是适合传统的显微镜,并对其进行修改是必要的。

无论所使用的试样制备的协议,在其中共聚焦显微镜下进行的方式的主要优点是在图像显示和分析的结果,从同时采集多个图像,以数字形式,插入计算机的灵活性。 这将在下面更详细地讨论的,但在图像显示可能性中的一种优雅的例子是在图1中,一个三重标记的果蝇胚胎在细胞胚阶段。 将试样免疫荧光标记的抗体,以3种不同的蛋白质。 后收集在共聚焦系统的红,绿和蓝色通道3相应的图像,这些图像可以通过将它们复制到不同的信道被重新安排。 通过评估从合并3所产生的图像中,最有效的颜色到的信道分配用于说明各种蛋白质结构域被选择。图1给出了合并后的三通道图像(组合红色,绿色和蓝色通道)。

大多数已被证明成功地制备标本的常规宽场光学显微镜的方法是专门旨在降低了焦荧光的量,因为这将产生光晕的图像,极大地减少了所感兴趣的特征的分辨率在。 由于通过共聚焦方法所取得的光学切片的共焦显微镜undersamples在一个厚的样品的荧光相比于常规落射荧光显微镜。 其结果是,样品可能需要增加染色时间或染色浓度为共聚焦分析,并且如果评价在常规的显微镜,可能表现为过度染色。(本文来源:尼康显微镜样品制备和成像

虽然在典型的激光扫描共聚焦系统的照明显得极为明亮,在试样上的任何给定的点的平均照度为相对适中,由于这一事实,即许多点每秒扫描。 以每1.6毫秒一个点一个典型的扫描速度,在任何给定点的实际照度通常比在传统的宽视场落射荧光显微镜更少。 它通常建议使用最低的激光功率是实际的成像,以保护荧光。 虽然许多协议包括一个antibleaching剂,以防止荧光物种的衰落,这种添加剂可以不要求有许多更现代的共聚焦仪器。

共焦显微镜的主要优点和应用是在较厚的标本改进的成像能力,虽然成功可以通过试样的特定属性来限定。 对于试样若干最低物理要求适用,它必须适应于显微镜载物台,和感兴趣的区域必须能够被放置在物镜的工作距离范围内。 在某些情况下,分辨率可以具有以容纳样品被破坏,并且要避免损坏它或物镜。 例如,高分辨率的透镜,如60X具有1.4的数值孔径可以具有170微米的工作距离,而一个20倍(具有0.75的典型数值孔径)可以提供相对较大的660微米的工作距离,以能够访问一个样本更禁区没有物理干扰。

具有三维结构,它是待研究的共聚焦显微镜标本,必须被安装在这样一种方式,以保护结构。某种形式的隔板,如渔线或一块盖玻片的,通常被放置在载玻片和盖玻片,以避免变形试样之间。 当活样品进行研究时,通常​​需要将它们安装在一个腔室,可提供所有的生命必要的要求,而且还允许足够的访问由物镜对图像中的所希望的区域。

物镜参数和光学截面厚度

物镜  小孔
放大 NA Closed (1 mm) Open (7 mm)
60X 1.40 0.4 1.9
40X 1.30 0.6 3.3
40X 0.55 1.4 4.3
25X 0.80 1.4 7.8
4X 0.20 20.0 100.0

表1

样品性能影响光传输,如不透明度和浊度,可以极大地影响激光束入试样的穿透深度,因此,能够被成像的结构。 眼睛的未定影的和未染色的角膜上皮,例如,是相对透明的,激光束将其渗透到约200微米的深度。 与此相反,未定影的皮肤是相对不透明和散射更多的光,从而限制了激光穿透至约10微米。 许多固定的协议包括某种形式的清除剂的目的是增加该组织的透明度。

如果有足够的激光穿透不能与一个整装样品实现的,厚的部分可以用切片机进行切割。 固定的组织通常用于切片,但组织(如脑活)已减少vibratome并成功地成像。 要访问一个部分较深部位安装,也可以从幻灯片中删除标本,反转它,并重新安装它,但这通常不是很成功。从样本的一个有点较深部分的图像可以通过使用被激发在较长的波长(例如花青5),相对于那些需要更短的波长激发的染料来获得。 使用较长波长的照明,然而,将略微减少,可以在比较在更短的波长获得的图像来实现的最大分辨率。 出于同样的原因,多光子成像技术允许图像被从样本内更深的层收集(由于使用的红色光为激发)。

物镜

对于共焦显微镜的研究,所用的物镜的选择是极其重要的,因为透镜的聚光能力,测定其数值孔径,是既分辨率和光学部厚度的决定因素。 持有其他显微镜变量不变,更高的物镜的数值孔径是,越薄的光学部分会。 作为例子,对于一个特定的仪器,使用的是60倍(1.4数值孔径)物镜与针孔的直径设定在1毫米是约0.4微米的光学部分的厚度,并且具有16倍(0.5数值孔径)透镜,具有相同的1 - 毫米针孔,截面厚度为1.8毫米的量级上。 通过打开针孔以较大的直径,该光学部的厚度可以增加。 表1给出了光学部分的厚度值(微米)的各种物镜在两个不同的针孔直径为研发中心的一个模型。 图像分辨率始终是垂直较差比它水平。 例如,使用60倍,1.4的数值孔径,物镜的水平分辨率为约0.2微米,垂直分辨率为约0.5微米。 场和色差的平整度时,选择一个物镜被视为额外的镜头特性。 在不同波长下成像的多标记标本时的色差校正的程度是特别重要的。

物镜,有能力的最高分辨率通常是那些具有最高放大倍率和最高的数值孔径。 它们也是最昂贵的,因此折衷经常被扫描试样的区域内,以及可实现该区域的最大分辨率之间进行。 如果成像昆虫胚胎和成虫磁盘,例如,一个4倍透镜可以用来定位在幻灯片上,一个16倍(0.5数值孔径)透镜成像整个胚胎,和40倍(1.2数值孔径)或60倍的试样(1.4数值孔径)的镜头解决胚胎或成虫盘内的各个细胞的细胞核。 用于成像更大的组织,如蝴蝶成虫盘,4倍带透镜将是整个翼磁盘有用,而40倍或60倍于单个细胞的分辨率。 图2(a)示出了使用了4倍物镜,以获得整个蝴蝶五龄翅成虫盘的整体图,并通过一个16倍的透镜(图2(b))所提供的额外核的细节。 在该高分辨率和大视场图像可以被组合的一种方法是获得许多图像从相邻的区域,并将其数字化组合成的蒙太奇。 有些显微镜具有自动,可以设置走动标本和收集多个图像到一个大面积的蒙太奇XY阶段。

其中比较有用的功能是最LSCMs的特点是使用相同的物镜放大的图像,在不损失分辨率的能力。 这种能力是通过减少由激光扫描时,通过扫描镜控制试样的面积,同时保持相同的图像的显示大小或存储器存储阵列的大小,有效地增加放大倍率简单地实现。 在这样一些倍数,而不会干扰样品或在视场中失去追踪的参考点与单个透镜来实现。 只要有可能,然而,更高的数值孔径的透镜,应使用的分辨率最大化,而不是使用较低数值孔径的透镜变焦。 用单透镜(40倍)放大的能力示于图2(CF)。 图中的图(c)显示了40倍的物镜(相对于16倍的视图面板(二))提供的额外核的细节。 至(f)的面板(d)是通过累进的,通过减少扫描在试样上的区域来完成变焦相同40倍透镜获得的图像。

许多共聚焦仪器设计的具有可调节的针孔,限制失焦的光到达检测器。 打开针孔到直径较大的生产较厚的光学部分和分辨率降低,但往往是必要的,以包括更多的样品细节或增加撞击检测器的光。 如针孔被关闭(缩径),该光学部的厚度和亮度下降。 分辨率增加,直到一定的最小的针孔直径达到,超过此分辨率不增加,但亮度继续降低。 针孔直径是达到这个条件是不同的每个物镜。

探针共聚焦成像

共聚焦仪器仪表的发展将继续影响两者并通过了提高免疫荧光定位新型荧光探针的合成受到影响。 荧光正在推出具有激发和更紧密匹配与大多数商业LSCMs提供的激光器产生的波长发​​射光谱。 改进的探针可以结合到目前的研究兴趣抗体不断发展。 作为一个例子染料组,花青已经发展成为替代其他历史悠久的染料,用花青3以罗丹明一个更光明的选择,花青5发现在三重标签的策略越来越多地使用。

荧光原位杂交(FISH)在分辨率和探头检测再加上激光共聚焦显微镜时,都进一步提高了灵敏度的优点,并且是在成像细胞荧光标记的DNA和RNA序列的分布有价值的方法。 此外,明亮的荧光探针是目前可用于在两个细胞核和染色体分离的总DNA的LSCM成像。

是可用的,当在相对简单的协议成立,特异性染色某些细胞器的结构和大量的荧光探针。 其中可用的探针的过多的染料标记的核,高尔基体,内质网,线粒体和,并且还染靶向肌动蛋白聚合的细胞,如荧光标记的phalloidins。 这种染料是在多重标记方法非常有用的定位具有特定车厢在细胞权益抗原。 例如,图3给出鬼笔环肽和核染料(TOPRO)与应用于蝴蝶蛹成虫翅整个磁盘坐骑三重标签计划相应抗原结合的就业。 如图3(a)所示,鬼笔环肽可用于强调细胞概述在开发组织中,与周边的肌动蛋白网状结构被标记为明亮的荧光环。 该图的图(b)示出了核染色的只有该细胞成分的戏剧性的特异性标记。 除了这个细胞区室标记策略,抗体在细胞中已知的分布或功能(例如,抗微管蛋白)的蛋白可有效地包含在多标记研究。

如果活细胞进行成像,但要注意的荧光染料加入到该系统的作用是至关重要的。 这些探头可以是有毒的活细胞,尤其是当他们兴奋的激光。 有毒的影响是通过加入抗坏血酸到细胞培养基中减少一些准备协议。 该标记的特定细胞成分可以在成像过程中影响细胞的活力。 例如,污渍的细胞核倾向于具有比细胞质染色更有害的影响。 探针可用,活的和死的细胞区分(这些之中,吖啶橙),并且可以在成像过程中使用的细胞活力测定。 大多数此类测定法是基于的前提是,死细胞的膜是可渗透的许多材料,如染料,不能穿透它们在活的状态。

荧光-3和RHOD-2是已被合成,以改变在某些离子如钙的存在下其荧光特性的染料的例子。 新的探针已经开发了用于成像的基因表达,包括,例如,水母绿色荧光蛋白(GFP),使基因表达和蛋白定位在体内被观察到。 利用绿色荧光蛋白基因,使基因表达的监测在许多不同的细胞类型,包括活果蝇卵母细胞,哺乳动物细胞和植物(使用激光共聚焦显微镜的激发激光的488nm的线)。 可用于在multilabeling实验使用的GFP与频谱发生变化的突变体,而这些也发现使用,以避免干扰自发荧光的活组织。

自体荧光

组织的自发荧光天然存在于许多类型的细胞,并且可以是背景干扰的主要来源成像期间。 例如,叶绿素在酵母和植物细胞中发荧光的光谱的红色部分。 某些试剂如戊二醛固定剂,是自体荧光的来源,这可以通过用硼氢化钠处理来降低。 自发荧光有时可避免使用,可以在波长上是出自然的自体荧光的范围内被激发的荧光团。 花青5通常被选择,因为它是在激发波长较长,避免了较短波长的自发荧光。

虽然这是最经常被认为是一个问题,组织自发荧光可以用于成像的整体细胞形态为multilabeling研究的一部分。 从自发荧光的荧光总量的贡献可以通过查看未染色标本在不同波长并注意到激光功率和黑电平和增益光电倍增管的设置进行评估。 自体荧光通常可以漂白由短暂暴露于激光的高功率,或从汞灯泛滥的标本光。 更复杂的方法来处理的自体荧光,包括使用时间分辨成像,或去除使用诸如图像相减的数字图像处理技术。

收录图像

共焦显微镜的初级用户能够获得在几个方面的经验。 由生产商提供的显微镜手册通常包含一系列必要的入门简单的程序。 在大多数的多用户设施的主要负责人操作仪器可以提供适应课程,或设施经理可能需要单独使用该仪器前一定专业水平进行短期培训和示范是允许的。 特别要注意对设备的内部规则。 信息和培训,也可以从显微镜公司进行的培训课程,从显微镜车间,并从各种出版物得到。

之前的工作与实验试样完成的,它是必不可少的熟悉成像系统的基本操作。 它通常是有益的新手开始试成像与一个相对容易的标本,而不是更困难的实验之一。 一些更好的测试样品包括纸浸泡在一种或多种荧光染料或制备的荧光珠。 这两种类型的试件是明亮的荧光,也比较容易图象用共焦系统。 另一个很好的样本混合花粉,表现出许多不同波长的自发荧光的幻灯片。 这些可以从花粉从园林植物收集容易地制备,或可以从生物样品中的供应商处购得。 图4中的花粉粒图像同时收集具有相同的PMT中的黑电平与增益和针孔的直径设定,但揭示了三种类型的花粉,每个荧光在不同的激发波长。 这些标本都是作为考试科目有价值的,因为他们不仅有一些有趣的表面细节,也维持其性能相对较好,当暴露于激光束。 对于活组织,从洋葱上皮细胞制备标本或自来水厂伊乐藻试验。 是可靠的,无论是使用或自体荧光染色DiOC6。

在尝试成像,共聚焦仪器应设置以获得最佳的性能。 这需要在优化比对,特别是当正在使用的较旧的共焦显微镜中的一个。 使用校准例程是高度针对特定的仪器,通常是最好的谁对维持它的整体责任的人完成的。 在任何情况下不对齐从显微镜的所有者适当的培训和许可尝试。 不当的程序用来尝试对齐可能导致梁的完全丧失,并可以在某些仪器的情况下,需要上门服务,以纠正。

共焦系统是基于传统的光学仪器和光学显微镜的基本程序和应遵循的做法在任何时候。 这是极为重要的是,所有的玻璃表面的光路是干净的,因为灰尘,油或油脂的载玻片,盖玻片和物镜差图像的一个主要原因。 在物镜和标本之间的折射率必须适合于所使用的透镜。 例如,正确的浸油必须用于一个给定的物镜的数值孔径,试样必须被安装成可在透镜的工作距离范围内。 盖玻片厚度必须正确使用的透镜,尤其是对于高倍率的物镜,这需要一个第一或1.5盖玻片代替第2号。 盖玻片必须使用适当的介质被密封在滑动,且安装平面。 指甲油可用于固定试样,如果是照顾,以确保它是成像前干。 凡士林,蜂蜡,和羊毛脂,或一些其它无毒的密封材料的混合物,必须使用与活标本。 遵循严格的基本清洁程序在试样准备阶段可以节省大量的时间和精力以后。

在准备共焦成像模式,一个地区的利益所在要么使用明或常规荧光显微镜 优选使用共聚焦系统的显微镜做这个调查,但它可以是非常困难的新手单独使用共焦成像模式找到正确的焦平面上。 如果传统的成像模式不可用共焦系统上,那么感兴趣的结构可以使用一个单独的荧光显微镜的位置,并使用金刚石标记在显微镜标记其位置,标记笔,或通过记录从显微镜的位置坐标阶段。 这是特别有用的,能够尝试图像时一个罕见的现象,如在发展的某个阶段中可能包含数百个不同年龄的胚胎标本表达的基因预览标本共焦系统的实际显微镜。 一个很大的时间可以被保存以这种方式,在具有使用共焦模式下扫描许多标本。 共聚焦工具通常具有低分辨率快速扫描模式,使初步扫描更有效率。 搜寻在很少发生的事件时,最好的方法,但是,是用常规的显微镜模式来扫描载玻片,然后立即切换到共焦模式在相同的显微镜采集图像。

成功的共焦成像依赖于掌握物镜的数值孔径,针孔大小和图像的亮度之间的相互作用,并且使用最低的激光功率可以达到最佳的图像的“秘密”。 新手用户应该尝试用试样和不同的放大倍率和数值孔径的多个物镜企图对实验标本成像之前获得的显微镜的能力感改变这些参数。比较应使用共聚焦系统的变焦功能与那些使用具有更高数值孔径物镜获得所获取的图像中。被成像的特定样品和特征将确定哪个镜片和方法是最合适的。适合于共焦显微术的许多物镜的两个例子示于图5。该数字包括一个60X planapochromat油浸镜头和20倍planfluorite。后者的物镜有一个调整圈,允许它与油,甘油或水被用作浸渍介质。

合适的样品特定显微镜的设置应设置远离所关注的主要区域,以避免在荧光物质中的标本有价值区域的光漂白。 通常,这需要设置的增益和光电倍增管检测器的黑色层次与针孔大小一起获得可接受的分辨率和足够的对比度之间的最佳平衡,使用最低的激光功率以尽量减少漂白。许多仪器利用设计设置正确的动态范围的图像,以帮助颜色查找表。 这样的表的设计,使最暗的像素,其在零附近的亮度值,可以任意显示为绿色(例如),各路像素,带亮度值附近的一个8位的系统255,显示为红色。 在显微镜参数,如增益和黑电平,并在针孔的直径,被调整以使只有几个绿色和红色的像素在图像中,从而确保整个动态范围为0〜255是利用,但很少有在截止亮度范围的任一端。 虽然这些调整可以通过眼睛进行,在所述成像系统的动态范围的两个极端的使用伪使得调节小得多主观。 在某些情况下,图像必须被收集在小于系统的全部动态范围,因为小于最佳激光功率必须使用或试样具有不均匀的荧光,导致亮区域掩盖调光区域,它是在帧中的兴趣。

在扫描试样的图像平均日常通常使用以减少随机噪声的检测系统,并加强固定(非随机)的特征在图像中。 一种图像均衡算法可以采集图像以它们扩展到显示器的整个动态范围的后应用。 应注意不适用的这种类型的常规的,如果要作出除非一个控制图像被包含在相同的帧作为实验图像均衡例程被施加前的荧光强度的测量。 在使用任何类型的图像处理程序,它是一个很好的策略,以保存原始未处理图像除了任何处理的。

在图像采集通常的策略是将图像保存到共聚焦系统的计算机的硬盘,后来将它们备份到其他大容量存储设备。 一般来说它始终是最好收集尽可能多的图像尽可能显微镜会话过程中,并在以后的审查丢弃不需要的。 许多似乎没有必要在首先考虑的图像经过进一步的审查(尤其是与同侪)成为非常有价值的在稍后的日期。 如果它似乎浪费采取看似多余的图像,认为它更难准备另一标本,并仍然难以重现的实验或确切的条件更加准确地复制试样制备协议。

成像开始之前的战略中一个内容丰富的方式标记图像文件应当制定。 在成像许多笔记应采取或添加到图像文件连同图像,如果这种能力是可以在系统上使用。 测试应该怎样做才能确保任何保存的信息是保存图像,同时要注意文字和相关图片等信息时,它随后被转移到诸如NIH图像或Adobe Photoshop上的其他图像编辑程序可能会丢失后访问电脑。 一个组织良好的笔记本电脑或笔记本电脑的文件可能是最好过的记录成像会议的细节等手段,并应包括文件名,注释和物镜的详细信息,并用来让计算比例尺在日后任何缩放系数。 大多数激光共聚焦系统不自动记录所使用的物镜,而这些信息对于计算字段宽度和比例尺后发表重要。 许多现代系统利用该组织的文件名和文件位置的图像数据库,这通常会显示图像的缩略图文件。 必须注意遵循由系统强加图像命名限制,如文件名,以及是否字符,如句点或空格可能被软件被误解允许的字符数。

故障排除

在任何实验学科,已产生了良好的效果的协议有时会莫名其妙地停止工作。 当这种情况发生时共聚焦成像实验,有可能是一个初始的反射责怪工具,而不是标本,但测试应进行,以确认该标本是没有过错任何疑难排解是开始在仪器前。 一个良好的第一项测试是查看在常规落射荧光显微镜标本。 如果某些荧光是由眼可见,信号应该是非常光明的正常运转的共聚焦系统。 经证实,荧光存在于试样,然后应使用已知的测试样品而非实​​验1进行共聚焦系统的一些测试。 为供参考,共焦系统应具有试样接触到显微镜的用户,包括其收集的所有参数,如激光功率,针孔的直径,物镜和变焦值和增益的图像的数字文件和黑电平检测器。

如果初始测试不提供明确的解决方案,最好是从谁可能都经历过这个问题的专家寻求帮助。作为一个规则,如果用户是不知道的东西,它是最好的,他们退后一步,尝试任何补救措施之前,寻求帮助。 所有供应共聚焦显微镜的公司都有热线电话和可能的额外的帮助来访问网站。

被跟踪的制备协议问题通常是由试剂的劣化引起的,这应该通过进行一系列的诊断测试来检查。 它通常是可取的做实验,以弥补自己的试剂,或者至少从信任的同事得到它们的人。 抗体应该从冷冻的股票在小批量,然后在冷藏条件下储存分配,而不应重复使用,除非绝对必要的。 有时这是不可避免的稀有或昂贵的试剂,而且往往不会出现问题。

在与多标记样品的实验中,放气通过从一个频道到另一个可发生作为试样本身的性能的结果,或者由于出现问题的显微镜。 发表评论文献应征询的渗色和可能的补救措施的原因的详细信息。 仪器本身的一个很好的测试包括测试样品与已知的渗色性的成像,同时使用多个标签和单标签设置。 试样的图像应该与所有相关的显微镜设置的记录被存储,这样,当问题发生做测试样品可以再次成像用相同的仪器条件和与存储的当仪器被称为记录比较图像要优化操作。

当出现问题时,可能会进行其它测试包括激光照明的颜色进行目视检查和激光器的阳极电压的检查。 如果,例如,一个多标签设置在扫描时从氪/氩激光束出现,而不是白色蓝色那么这可能表明该红线是微弱的。 在这种情况下,阳极电压可能会太高,并且通常可以通过调整激光的反射镜被降低到可接受的水平。 这样的调整应做由或,负责维护的共聚焦系统的人员的监督。 如果电压不能被带入一个可接受的范围,则可能需要替换为激光。

可能遇到的另一个问题是,抗体探针可能具有劣化或需再纯化或以其它方式清洁。 已制备了一段时间的标本可能发展增加背景荧光和渗出通过引起从二次抗体的分离和扩散到周围组织中的荧光染料。 如果可能的话,成像应进行对新制备的试样。 有时候,改变浓度和/或荧光染料的分布将有助于减轻问题。 作为一个例子,荧光素可能出血进入罗丹明信道,并且可以切换成使罗丹明是强信道上。 这样做的理由是,在荧光素的激发光谱具有一个尾部重叠带和被激发的若丹明波长范围。 在随后的实验中,次级的浓度可以降低。

图像处理和出版

用共聚焦显微镜获得的图像通常保存在一个格式,使他们能够使用提供的共聚焦系统的一部分的专有软件很容易被操纵数字的计算机文件。其中电流LSCMs的最显着的改进的功能是共聚焦图像的显示。这是非常重要的,因为用共焦显微镜成像的改进的小值,如果没有办法有效地显示图像或再现它们作为硬拷贝。

就在最近的5年左右前,大多数实验室仍在使用传统的摄影暗室和胶片和纸张化学处理图像的最终硬拷贝。有在再现彩色图像特别的困难,因为他们通常由独立的打印机谁往往有什么构成的显微正确的色彩平衡一点想法印刷和品质的打印成本是很高的。获取图像的硬拷贝现在,图像文件可以导出到幻灯片打印机,彩色激光打印机,或染料升华打印机出版的打印质量,与直接控制谁收购的人得以维持的形象特征图像。对于照片打印或幻灯片可以直接从视频监视器屏幕采取和电影序列可以在网络上被公开。

大多数期刊是现在能够接受数码图像文件的发布,这导致在公布图像质量的显着改善。现由共聚焦成像系统实现了图像的质量可以更忠实地再现发表文章。在某些情况下的期刊也使他们的文章可以在CD-ROM,这意味着读者可以访问发布的图像,正是因为他们出现时,这些做研究的共聚焦系统收集。毫不奇怪的图像采集,显示和发布的技术进步是特别有益的该期刊的彩色图像的情况下,现在可以精确地再现图像的原始分辨率和色彩平衡,并从理论上说,以低得多的成本给作者。