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徕卡显微镜布氏锥虫的冷冻置换

2014-03-19  发布者:admin 

 生物标本的超微结构研究化学固定是一个相对缓慢和选择的过程,因此工件的一个共同的来源。 冻结,另一方面,是身体修复的生物标本的全部和无延迟的好方法;冰晶大到足以取代细胞物质和破坏结构的形成,会是这样,但是,一个主要的问题。 因此,生物样本必须被冷冻或在阻止水分子的重排成为晶体,并导致amorphously固化(玻璃化)水的速度或以这样的方式所形成的晶体是小到足以符合的分辨率观察法。 对于非常薄的样品,这可以相对容易地实现通过浸入到合适的冷却剂。 但是,热的差的传导从试样的芯的外围上施加样本,可以通过这种方法在环境条件下被冻结,即使有一个无限的冷却速度在表面的尺寸限制。

以抵消破坏性的冰晶,即使在像大细胞或组织的片较厚样品的形成,高压可以使用:这降低水的凝固点,从而减少了需要进行划线,以充分保持标本或者在临界温度范围玻璃化(理想情况下)或高压冰晶形成于约10纳米更小。 此外,在高压(〜200兆帕/ 2,000 bar)的不同晶型的冰为准这似乎是破坏性较小。 这一原则在高压下被用于冷冻(HPF),因为停泊和里勒介绍了它在1968年。 如今,商用仪器使用的压缩机和气动这一复杂的系统,以产生高的,这是冷却试样之前立即施加的压力。

2009年,一月Leunissen和洪易提出了不同的冷冻技术采用同样的原则,以防止冰晶的形成:而不是使用外部产生的压力,他们使用的压力建立起来的样品由内冰晶形成的一个部分一个密封的金属管,以防止结晶在相同体积的另一部分。 示出“自增压快速冷冻”和冻结取代的古细菌,酵母细胞,和秀丽隐杆线虫,它们可以证明,这种方法可以作为一种替代HPF对于可以在用于冷冻的小铜管被容纳标本。

1(左图)和图2(右):SPF冷冻Typanosoma布氏后冷冻置换,包埋,超薄切片后和染色概述图像。 注意质膜的优异的保存和细胞质中。脂滴被看作是细胞内的电子致密的球体。 周围的细胞,鞭毛的横截面可以观察到(→)。

 

这些最初的实验中使用手动浸入的制冷剂,与相关的有限的控制权冻结参数。 管内保存完好的标本出现并排损坏的。 为了提高可重复性和产量,徕卡显微系统公司开发了EM SPF与Leunissen,仪器自动化自我加压快速冷冻,这成为市售在2011年的合作。 相比原来的做法,这种仪器是利用U形管,而不是直的人冻结,以提供功能不同的区域,分开保存完好,损坏标本:在一个区域的冰形成,供应增压,而在第二区的试样仍处于液态的环境和在高压下提供适当的结构保护了基础。

下面的报表显示实现了与EM SPF-冻结和布氏锥虫的寄生虫致病的非洲昏睡病的随后的冷冻替代的结果。 构成该技术是一个挑战,这个有机体称为是出了名的难以维护以及为少数族裔被选定作为一个模型系统。 虽然这里介绍的协议可以提供一个起始点,不同样本将需要额外的实验以确定用于装载样品放入试管中,冷冻培养基的组成,并在用于浸渍速度和深度的仪器设定最佳条件。

3:显示布氏锥虫的鞭毛基部有丝分裂的开始高倍看法。 皮质微管(c)和轴丝微管(a)中明显的切线部分。

 

材料和方法

布氏锥虫培养在悬浮液中以300g离心5分钟。 除去上清液后,将100μl的沉淀再悬浮于1体积在DDH 2 O的20%BSA的 将悬浮液注入用20微升的移液管与切尖,直到它被完全填充,置换所有气泡15.8毫米U型管。 该填充管,然后转移至2毫升塑料管和离心弧下来与摆动出转子(!)3分钟在300克 Leica EM SPF冷冻用的浸渍速度25毫米/秒,没有浸没延迟,浸没深度6.7毫米执行。(本文来源:徕卡显微镜布氏锥虫的冷冻置换

冷冻后,将管切成LN 2下2毫米段。 这些片段被转移到冷冻替代媒体在-140℃下,含1%的OsO 4和0.1%醋酸铀在无水丙酮。冷冻置换,进行中的Leica EM AFS2用温度程序如下:

  1. -140°C
  2. 升温至-90℃,增量为25°C /小时
  3. -90℃下50小时
  4. 升温至-54℃,增量为2℃/ h的
  5. -54℃下8小时
  6. 升温至-24℃,增量为5℃/ h的
  7. -24℃下15小时
  8. 升温至0℃,增量为48°C /小时
  9. 0℃下进行2.5小时

样品在0℃下洗涤3次,每次10分钟,用无水丙酮 对样品进行渗透在琼脂100树脂(中等硬度),2:1,1:1,1:2,纯树脂用丙酮超过4天的过程中混合。 树脂的聚合在60℃下24小时。

样品修整用玻璃刀切片和70纳米用金刚石刀。 在此之前,在80 kV的透射电子显微镜,切片进行后染色用醋酸双氧铀和柠檬酸铅。