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尼康显微镜体视斜照明

2014-03-18  发布者:admin 

 使用传统的传输(diascopic)明照明技术在立体显微镜观察标本时,几乎是透明的,无色的可能几乎不可见。 这是因为光一秒标本细节衍射是四分之一波长的相位穿过样品直射光时,都被重新组合在中间像平面,一个经典的现象,严重降低了在明的图像对比度。

但是,如果光照被引导,使得它来源于一个单一的方位角和从倾斜的角度照射到试样,在试样的细节可以与比当光被允许直接通过样品的特性来传递更大的对比度和视觉清晰度显示沿所述显微镜的光轴。 相位和折射率梯度在试样偏转的光线通过衍射,反射,折射和,因此,只有零阶(未衍射)和衍射光的一个或两个边带可以重组在图像平面上。 这产生了具有区域显示阴影和高光浮雕状图案样本,很像是用微分干涉对比(DIC)技术在复合显微镜观察。(本文来源:尼康显微镜体视斜照明

示于图1是一个现代化的立体显微镜照明支架(尼康斜相干对比度(OCC)diascopic模型),其物镜是通过从轴向明高度倾斜离轴光线的渲染可见的透明标本的过渡机制,以照亮标本在计划中的极为相似暗场。 支架包含了整个体视显微镜物镜放大倍数(一般0.5倍至2倍)和数值孔径(0.07〜0.21)范围内的两个高,低数值孔径的聚光使利用率。 斜光通过滑动隔膜该遮蔽光束的中心,以产生部分相干光源,这是斜向投射到试样,产生高对比度的图像来实现。膜片的位置由可用于调整照明的倾角的旋转旋钮来控制。

标本被放置在尼康OCC透射底座的玻璃阶段和可照明无论是在明场,暗场,或者不同程度的偏斜照明的,通过旋转光圈控制旋钮。 一系列在偏斜照明的连续级别捕获的数字图像示于图2为一个半透明Nemathelminth( 钩虫, 犬钩虫 )标本。 正如图2是显而易见的(一),未染色钩虫是半透明的,而且非常小细节是根据明轴向照明透露。 然而,当滑动隔膜旋转入光路,提高度偏斜照明,可以实现(图2(b)所示,图2(c)和图2(d)),与对应的紧密合作,以暗视野照明的最极端位置从一个单一的方位角。 在标本的对比可能与此照明立场的变化是最显着的比较图2描绘(a)和图2(c),其中产于明和高度倾斜的连贯对比,分别。

之一的尼康斜立体显微镜照明支架的主要的设计标准是使增强图像的对比度,例如可能与光阑实现,同时维持高聚光器的数值孔径匹配的能力,通过复消色差的物镜显示的。 具有并行或共同的主要物镜(CMO)设计的许多立体显微镜耦合到照明看台,配备光阑,无论是内置或作为附件提供。 为了增加景深,光圈孔径通常的尺寸减小,这也有助于提高在透射照明图像的对比度。 遗憾的是,减小可变光阑的大小还使得该图象形成光线更加连贯,并通过减小物镜的工作数值孔径损害了显微镜的分辨能力。

斜相干对比度的照明系统结合了通过降低聚光镜孔径光阑大小得到的相干增强偏斜照明的效果,并产生具有相似的差分化合物显微镜产生的干涉对比度的图像的外观在立体显微镜图像。代替使用一个光圈孔径光阑,倾斜相干对比系统采用一个挡板,它作为一个滑动隔膜 。 线性隔膜机制表现为虹膜会如果放置在相同的位置,但该物镜保留了大部分它的分辨能力。 这可以实现,因为该照明锥的数值孔径减小,但是,该物镜是没有的。

照明通路,表征尼康斜立体显微镜系统被示出在图3中,其中也给出了光通路的正常的明(diascopic)的条件。 聚光透镜系统聚焦在灯丝的像投影到定位在相对于两灯和试样的光学轴成45度角的镜子。 滑动隔膜是一挡板,可以在整个反射镜的表面被翻译以阻挡光线将通常直接穿过样品,确保只有斜光被用来照明样品的细节。 聚光透镜定位在所述反射镜通过使挡板的锋利边缘聚焦在物镜的后焦平面保持光的相干。 物镜的后方瞳孔将仅部分地填充有轻,因为由滑动挡板的位置(在充当可变光阑)测定。

与该系统中,物镜的整个数值孔径被保持。 之一的尼康倾斜系统(超过其他偏斜照明技术)的优点是易于由一个单一的调节旋钮,它控制所述滑动挡板的位置的装置,明视野,偏斜,和暗场照明之间进行转换的。 与挡板试样的外观移离镜等同于见于正常明场照明。 与挡板移动到所述反射镜的顶部,图像将类似于暗场,并在这两个极端之间,真偏斜照明条件而异。 倾角的程度容易地调整以适应样品和所期望的细节的类型。

斜光在许多方面只是将暗场技术相似,而不是从所有的方向以倾斜角度被点燃试样,光只从一个单一方位投影。 各种照明场景都被用来观察标本的立体斜向提供定向照明(一个例子是在图4)。 简单diascopic碱通常配备有倾斜反射镜,可以进行调整,以提供一定程度的偏斜照明,但光不容易控制,并且不提供的视图中的均匀场。 更复杂的显微镜台(或碱基)有额外的控制的可能性,包括倾斜反射镜并非限于单个轴和滑动,可以进行插入和从光路取出的反射镜组件。 某些模型使用一个或多个滑动挡板来限制照明几何形状,并确保只有斜光照射试样。

任何这些技术可以提供可以接受的良好的效果上各种各样的标本,但大多数需要一个显著程度操纵涉及的照明通路,这往往是难以定量分析或再现。 涉及艺术多于科学,实现了在立体显微镜斜照明的业绩高度依赖于显微镜的技能,经验和耐心。 大量的照明方案已经制定,这进一步复杂围绕这一技术提高标本的对比问题。

通过该斜光增强细节中另有几乎看不见,无色标本的机构最好是由考虑了偏斜照明技术的理解为它是常用于传统的复合显微镜说明。 直射光从台下聚光器中的一个方位从单一的一侧照射标本。 斜光通常是由放置一个狭缝或扇区停止下透镜和聚光器的孔径光阑的下方,通过光阑的窄开口,只允许斜光穿过以照射样品来实现。 斜照明的效果是通过样品的光通过零阶移位到物镜孔径的外围。 零级的一侧的移位使得一个或多个额外的高次衍射光(边带),以被包括在物镜的后焦点平面,并有助于图像形成。 在许多情况下,其结果是在增加的光学分辨率,因为第零和一些更高的订单都有助于形成图像。 此外,该技术还产生具有阴影,高浮雕的功能,使该试样的伪三维外观的图像。

时相比,暗场技术,其中样品是从所有方位照射高度倾斜的光,不对称的斜光产生的图像,其字符高度依赖于照明的入射角度。 由斜光产生的图像是不对称在于边缘躺在垂直于入射照明光的方向是由可见光检测,而那些平面平行(或接近)于该方向都没有。 这个概念是对两个试样在不同的方向相对于入射光倾斜照明的角度,如图5所示。 如图试样5(a)和图5(b)由从铝酸镧,即通常使用的底物的高温超导陶瓷外延薄膜沉积的钙钛矿型的薄单晶晶片得到相同viewfields。 结对在这些晶体妨碍汇合的薄膜形成,并且可以具有对得到的膜的性能产生有害的影响。 在图5中提出的数字图像(a)示出由孪晶畴时,晶体的取向与双轴线平行于斜入射光线的纵向生成的伪浮雕。 与此相反,当晶体(和双)轴被旋转90度,因此,它是垂直于入射光线(图5(b))时,孪晶畴变得显而易见。 这代表了对下斜照明观测到的肌理效果试样取向限制壮观的显示。

观察半透明山羊毛纤维在几个方位角度斜射照明时类似,但不显着,结果获得的。 当杆状头发缕的长轴方向平行于入射斜光(图5(c))中,在中心部分和毛纤维的边缘结构细节被揭示。 这个细节不存在时,毛发纤维的取向垂直于照射轴(图5(d)),和一个显著差异是在两个方向之间的角度的纤维的表观厚度变化。 纤维取向平行于入射照明似乎比那些取向垂直于光源厚得多。 因此,显而易见的是,在偏斜照明技术不能可靠地用于产生从用这种​​方法收集的图像忠实的测量数据。

通过斜照明技术,得到表观立体效果并不代表实际的试样的几何形状或形貌,并且不应该被用来进行试样尺寸的测量。 在斜光图像的真值是在折射率或样品,使形态和内部结构布置也可以更清楚地理解范围内的其他光路的差异揭示的转换。 该技术可应用于各种显示几乎不可见的或透明的明场照明的材料,不能被染色或以其他化学或热处理,以提高对比度。 研究活的有机体,并如在体外受精 ,玻璃或丙烯酸纤维,化学晶体,以及其他未染色的材料的方法可以通过一个容易控制的偏斜照明系统的利用率变得容易。