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徕卡显微镜共焦光学截面厚度

2014-03-16  发布者:admin 

 共聚焦显微镜被用来光学切片同等厚的样品。 最直接的问题是:1.什么是“同等厚的样品”和,2. 有多厚实际上是一种光学部分? 这两个问题是相关的,即厚的样品是assumedly比光学切片厚至少大约10倍。

在生物样品可具有任意厚度为10米(整个动物)至10纳米(ULTRACUT准备用于电子显微镜)。 如共焦显微术是一种入射光线的方法,所述样品本身的尺寸可以是几个厘米或更多,但穿透深度的表面下取决于材料的不透明度和物镜的自由工作距离。 这就限制了样本量(Z方向)的考虑到几毫米在最。

对于光学切片的决定因素是衍射极限轴向焦点尺寸。 根据不同的参数,在真共焦扫描显微镜的光学切片厚度达到降低到约 0.5微米。 厚的样品相对于0.5微米的切片,然后在5μm以上。 一个非常典型的数字为用于标准的共聚焦应用(如组织切片),样本为50微米。

 

三维点扩散函数(PSF)和半最大值全宽度(FWHM)

定义在真正的共焦扫描系统(TCS)的光学部分的厚度和测量。的全宽度半最大值(FWHM)被用作参数来描述切片性能。以确定FWHM,的xz更新部分被记录和显示在点扩散函数(PSF)的中心强度分布。中的强度分布的峰值的50%的值之间的距离是半峰全宽。
1:全宽度半最大值在z方向上的强度分布(FWHM)被用作光学切片性能的量度。 点扩散函数 - 通过一个足够小的乳胶珠产生的 - 记录通过收集力度的xz个人资料部分。 中的衍射图案的中心强度分布被显示(在此为红色)和50%值之间在Z的距离测量值(绿色指示灯)。

这是一种由光学系统产生的点(点)的图像被称为“点扩展函数”(PSF)。 点扩散函数描述了从一个维数少斑中的光发端三个维度的分布。 该衍射图案的芯具有一个椭球的形状,并控制光学分辨率。 的径向尺寸规则的横向分辨率,轴向尺寸规则的焦点深度,因此,平滑性能。

共聚焦切片,目标是传输PSF,它定义了光学部分的唯一的内芯。 由于事实上,针孔直径控制多少光从芯外面被发送。 光学部分,是在衍射图案的大小的范围是如此明显不锋利的像面包片,但其特征在于由一个同等持平斜率。 连接上的强度分布的两侧的50%强度在Z的距离被称为“半峰全宽”(FWHM),并按照惯例这被用作光学切片的厚度的测量。光学切片性能通常通过集中通过表面镜计量模型的无限薄的结构在Z。 这个方法是(同等)方便和用于检查共聚焦显微镜系统的性能。 或者,更实际地,Z切片性能是衡量fluorochromated乳胶珠(参见图1)。 荧光珠允许表现在非相干的条件来衡量,这是真正的荧光成像,因而适合在生物医学科学共聚焦绝大多数应用。 在反射光模式(镜像)的衍射极限的光学部分是显著稀释剂相比,在荧光模式的部分。 这是重要的是要记住,如果从比较文学的数字。

 

参数控制的光学切片厚度

在理想条件下,最薄的部分可以实现只通过光衍射依赖限制。 最明显的是波长,它控制的PSF的大小成比例:波长越短,越薄切片。 我们可以假定激发光进行限制(而不是发射的)的波长,如将没有被照空间外发射。 第二个参数是物镜(数值孔径,NA)的孔径:较高的NA(收集的信息更宽的角度),越薄的光学部分。 此外,样品的折射率影响轴向分辨率并且因此切片性能。 切片的大小DZ对这些参数的依赖关系是由公式图2中给出。(本文来源:徕卡显微镜共焦光学截面厚度

第三个参数是针孔直径在检测路径,被假定为零对于上面给出的公式。 因此,这个公式给出谁也无法预料的荧光成像的最佳价值 - 只是理论上的兴趣,当然:直径零针孔不会产生明亮的影像!

光学部厚度(FWHM)在一个真正的共聚焦扫描系统作为波长和数值孔径的情况下荧光的函数。
 2:衍射极限的光学切片最小厚度从荧光样品。 针孔直径被假定为零。 半峰全宽(FWHM)在一个真正的共聚焦扫描系统。
 

光学截面厚度影响

数值孔径NA对切片厚度的显著(1/square)的影响。 在每平方英尺的径向延伸线性依赖于NA。 因此,对于低数值孔径的透镜,涤纶短纤核心变得非常长形和切片很厚。 因此,大多数应用程序都使用浸没透镜NA> 1,其中xy和z维度的比例接近2个大致的一个因素。 作为一个经验法则,具有高数值孔径透镜的Z部分大约是两倍的XY分辨率。

理论上的考虑有助于估计光学系统的性能。 在现实中,这两种仪器和样品引入从所计算的数字偏差。 该仪器必须以获得最佳性能调整和精心操作。 和样品本身就是分辨率的敌人,尤其是如果它涉及到更深层次的成像。 因此格外小心,必须采取折射率匹配,正确的和恒定的温度和适当的盖玻片的选择。 该理论将得到一个经验法则,但样品和设置可能会引入显著偏差 - 经常无法回避的,因为生物样品比晶体更复杂( - 或真空)。