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徕卡显微镜的新型光学结算方法允许整个组织的深层成像

2014-03-13  发布者:admin 

 图像整体无脑切片? 无需重建研究神经回路? 在不破坏细胞结构进行分子分型? 了解大脑分子的分辨率和全球范围内一直面临着挑战。

小说CLARITY方法,由Deisseroth实验室,斯坦福大学,美国开发,推动深部组织的成像大步前进的障碍。通过使老鼠大脑光学透明,同时保留了原生的分子结构,它现在很容易可以调查亚细胞结构,神经网络和生物分子甚至整个完整的器官的配合物。

1:三维澄清的小鼠大脑的渲染(Chung等人2013)。
 

脑成像方法至今

迄今为止,大脑的映射可能只在有限的方式。 由于光散射的组织,常规的深部组织成像由多光子显微镜被限制为约1mm的组织深度。 调查位于市中心大脑结构和蜂窝网络时,样品必须切片,研究了小卷。 单个神经元的预测,需要遵循跨多个切片样本。这是精心设计的。 新的工具正在不断开发:自动切片方法减少繁琐的工作,尽量减少组织损伤,以及新颖的软件便于分析和重建。 然而,重建可能不总是可能的或足够的神经元回路的详细分析。 使用有机溶剂的新的光学信息交换方法降低光散射和图象更深的组织。 但这些方法离开脂质双层完好无损,那么他们仍然充当扩散屏障。 光与大分子的整装染色方法的普及率仍然有限。

如何实现大脑清晰

CLARITY( 缩写为清除脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/原位杂交,组织相容水凝胶 )是简单,因为它是辉煌的。 完整的组织被转化为水凝胶组织的混合体。 类似于石化或僵化,组织的物理结构保持完好,并能防止崩解。 光散射脂质被去除,而蛋白质和核酸被保留,因为它们被共价连接到所述水凝胶的网格。

在第一步骤中,所述组织是注入的丙烯酰胺/双丙烯酰胺,甲醛和一个热敏启动器,在4℃(图2)。 甲醛交联的组织并共价连接的单体的水凝胶的蛋白质和核酸。 脂类和生物分子缺乏官能团不结合,因此,可以被删除。 只有8%的蛋白质是通过此方法失去了(相对于25〜40%与传统的定影和增溶)。 聚合是通过升高温度至37℃。触发 组织现在是一个水凝胶混合。 网格支持组织结构及其纳米孔允许大分子进入。(本文来源:徕卡显微镜的新型光学结算方法允许整个组织的深层成像

脂双层是由电泳组织清算系统(ETC)除去。 在一个特制的电泳室,样品被放置在一个离子型去污剂(4%SDS,十二烷基硫酸钠)和一个施加电场。 高电荷离子的SDS胶束去除脂类积极。 ETC具有上述标准的有机溶两大优势:

  1. 它不解渴荧光像许多有机溶剂。
  2. 去除脂类的快。 洗涤剂的被动扩散将需要长达几个月彻底去除脂肪。

通过安装澄清大脑中像甘油或FocusClear一个折射率指定的解决方案®的完整的大脑变得完全透明,并准备进行成像(图2B)。

2:净度方法的描述:步骤1:组织是在4℃下注入丙烯酰胺/双丙烯酰胺,甲醛和一个热敏启动器 步骤2:甲醛交联的组织并共价连接的单体的水凝胶的蛋白质和核酸。 脂双层是由电泳组织清算系统(ETC)除去。

 

整个成像的大脑

所有传统的激光扫描显微镜技术是适合成像的净度处理的组织,因为每个激发和发射波长可以穿透深入到组织中。

成像深度主要受限于物镜的工作距离。 3.6毫米的客观需要两个大脑扫描:第一背侧半,然后腹侧。 远距离的物镜,使图像在一气呵成的整体器官。 在神经科学学会2013年会上,徕卡呈现最新的目标发展:一个特殊的CLARITY目标与机动修正衣领设计为全器官成像的最大成像深度,并与将在2014年成为可用的最高分辨率。

成像技术

一般原则

优点

限制

单光子共聚焦显微镜

通过共焦激光共聚焦针孔去除失焦的光​​实现

  • 适合于多色成像荧光标记范围广泛
  • 用失焦的激发光全组织的光漂白
  • 性能依赖于样本的分散

双光子显微镜

通过激励的大约两倍的波长的两个光子 - 和一半的能量 - 必要单光子激发。 无针孔必需的。

  • 漂白限制在焦平面上。
  • 高效的检测与非退探测器。
  • 通过红外激发光的散射减少增加深度。
  • 不是所有的荧光标记适当
  • 所需的脉冲红外激光器

表1:适用于CLARITY成像技术。

新的可能性的世界

是什么让CLARITY如此令人兴奋的是,你可以调查任何你想要在一个单一的大脑。 蛋白质复合物,基因表达分析,神经回路 - 你不必来决定你想看到什么。 看着这一切,一前一后。

纳米多孔水凝胶网状透气是大分子,并允许探头的快速扩散。 抗体染色容易,即使是在多轮。 混合的稳定框架允许抗体被淘汰用SDS。 相反,使用有机溶剂的常规方法洗脱,随后染色的荧光是不灭的。 即使在连续3轮染色和去染色,没有损失图像质量(图3和视频)。

因此能够遵循通过大脑轴突突起长距离。 显示配对前和突触后蛋白的共定位甚至允许单个突触的调查。 并采用经典的荧光显微镜后,该组织仍然适用电子显微镜观察细胞结构更加紧密。

该方法不限于新鲜的脑组织。 它也成功地用于长期固定的人尸检脑组织或斑马鱼胚胎,开启了新的可能性,研究神经系统疾病,或胚胎发育。

净度给出了其结构和分子信息,并添加到大规模的完整的生物系统的理解。 总之,清晰度革命性的基础研究。

 

 

图3:小鼠海马显示EYFP表达神经元(绿色),小清蛋白阳性神经元(红色)和GFAP(蓝色)(Chung等人2013年)的三维视图。

 



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