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尼康显微镜Lambda堆栈的基本概念

2014-03-12  发布者:admin 

类似的概念来使用的激光扫描共聚焦或解卷 ​​积显微术高数值孔径物镜较厚的标本中获得的光学部分 (  z栈)中,lambda堆栈的三维数据集,它由使用相同的试样场的图像采集在不同的波长带,每一个横跨有限的光谱区域范围从2到20纳米的获取。 相反,在各种形式的光学显微镜的典型成像方案涉及在检测器的整个波长响应频带获取单个图像(或一个连续组中的延时实验图像)。 本教程探讨一个lambda栈的频谱分量。

教程初始化与在上左角随着三重标记的标本表达靶向至细胞核,线粒体和肌动蛋白网络的探针的伪彩色图像3荧光蛋白谱(ECFP,EGFP,EYFP和)的曲线图元。 一叠拉姆达部分出现在左下方的角落。 为了操作的教程,使用LAMBDA堆栈深度滑块从拉姆达栈,这是直接到堆栈的右侧显示在一个窗口检查单个图像。 另外,使用AUTO按键,通过堆栈自动播放。 为不同的部分呈现,未混合和伪彩色版本被同时显示在检体图像窗口和光谱上的箭头指示的带通区域的位置。

光谱成像LAMBDA堆栈解剖

为了更好地理解在lambda栈的概念(通常也被称为在文献中作为图像立方体光谱立方体),在横向维度图像的单个像素的位置(具有坐标 x I,Y i)的沿波长被检查(Zλ)轴。 如图1(a)中的像素的强度和/或颜色分别改变为荧光发射信号的强度和波长,一个函数,当从拉姆达堆的一端到另一监视。 通过绘制像素强度与波长的线性图(参见图1(b)),特定的荧光团在空间上位于像素的发光光谱曲线,我可以很容易地确定。 但应注意的是,使用这种技术获得的发射光谱的精确度和分辨率是聚集在不同的波长带,在各波长带中的纳米的光谱宽度(较短的带宽产生较高分辨率)的λ堆栈的图像的数量的函数,所研究的样品的物理质量和检测器的光子的灵敏度(量子效率)。

在使用具有重叠谱3荧光蛋白活细胞获得的激光扫描共聚焦显微镜的lambda栈的一个真实世界的例子示于图2。 在本实验中使用的荧光蛋白标记物增强型绿色荧光蛋白(EGFP从水母;发射最大值在507纳米),增强型黄色荧光蛋白(EYFP从水母;发射最大值在527纳米),并Kusabira橙色(MKO的单体版本,发射最大值在561纳米),从天然存在的珊瑚蛋白开发了一种高性能的探针。 在这种情况下,个别的lambda堆栈的图像进行扫描,在10纳米的波段范围为480至640纳米(图2(a)),以产生总共16个谱段的荧光蛋白的混合物。(本文来源:尼康显微镜Lambda堆栈的基本概念

在lambda堆栈的第一图像显示在480到490纳米的发射范围的样品的光谱特征,而所述第二图像包含从490到500纳米的发射数据(请参阅图2(b))。 注意,几乎所有的前两个拉姆达部分的荧光发射的来自EGFP的短波长尾巴单独只用从EYFP长波长段(490至500纳米)的非常小的贡献。 在接下来的两节拉姆达(500〜510纳米和510到520纳米),从EYFP的贡献稳步增加从EGFP达到一个平台发射。 在520和550纳米之间的λ3的部分,在EGFP信号逐渐减小,从EYFP发射的贡献达到最大值在约530纳米。 同样,从MKO发射贡献变成在带540和550纳米之间更显著。 因此,在550到560纳米波段,从荧光蛋白的相对贡献是约10,25,和65%分别为EGFP,EYFP,和MKO。

荧光蛋白LAMBDA堆栈

排放贡献来自EGFP和EYFP在最后的波段(560〜640纳米)成为削弱来自人民圣战者组织占主导地位的排放。 在审查中,波段在拉姆达栈是由最短和最长波长的发光蛋白,EGFP和人民圣战者组织,分别占主导地位的特征排放贡献(480到500纳米之间590到640纳米之间)的极端。 在lambda栈(500至590纳米)的中心的波长带包含代表来自三个荧光蛋白的一些贡献的荧光发射。 如下面将要讨论的那样,该混合发射信号的整个拉姆达堆栈的波长带的分布可以从每个探针使用的参考发射光谱图清楚地分离出单个的荧光蛋白质的贡献是线性非混合。