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徕卡显微镜激发共聚焦

2014-03-10  发布者:admin 

 荧光激发需要专门的彩色光:它应该有效地激发探头(接近激发最大值),但留出空间,收集没有蔓延到检测路径的排放。 在激光共聚焦显微镜,是用经典的多行激光或激光“电池”。 这种安排需要挑选所需的线,适合当前使用的荧光装置。 强度控制是必须完成的另一项任务 - 最激光器将显示增加的噪声强度时,是在源头直接控制。 的声光可调谐滤波器的引入简化了过滤,并在同一时间显著改善的灵活性。

滤光轮 - 早期的方法

光源,用于在共聚焦显微镜荧光激发是激光器或激光器具有不同颜色的组合。激光器用于技术原因。 不幸的是,传统的激光器发射出通常只有一个单一的波长,或只有几行(一个现代化的解决方案是白光激光器)。 然而,用在生物医学成像表演激发带在近紫外和近红外的光谱中的任何地方荧光染料。 在大多数情况下,有必要从几个不同的荧光染料在同一时间拍摄的排放。 为了完成这个任务,一系列的激光束是由二向色镜组合。 在这种情况下,反射镜采用的是逆模式相比,“分束器”分隔的激发和发射光的荧光照明。(本文来源:徕卡显微镜激发共聚焦

由于激光器一般有低噪音运行一个可比窄带,这是不可取的,直接由激光功率控制力度。 因此,一个设备是必要的,使激光强度来单独地衰减。 类似地,如果源被关断激光寿命将减少,并且在许多次。 气体激光器特别是不要在高温下承受功率时仍。

一个典型的实现所有这些要求是“激光电池”,由一系列激光(一般为3〜5)。 所有激光器都配备了驱动机电和控制软件的光闸。 所有的激光器需要一种伺服控制装置 - 用于衰减 - 一个车轮或滑块与灰色滤波器的序列。 多行激光器需要在另外一个滚轮或滑块的,它包含了一系列的边缘和带通滤波器,以挑线单行或组合。

很显然,整个安装程序可以变得稍微拜占庭,很容易出现偏差和漂移的问题,它可能会在过滤器选择引进的机械振动。 这也是很慢的时候光照制度需要进行修改,并且由于适合在滚轮或滑块过滤器数量有限,设备也很灵活。

激光用电池,因为在早期的共聚焦显微镜出台,如徕卡激光共聚焦显微镜和徕卡TCS 4D。该系统是相当不灵活,较一AOTF的解决方案,是非常优雅由雇用产生超连续谱的设备,如徕卡TCS SPX白光激光(WLL)系统实施的最新进展所取代。

1:古典“激光电池”5激光管,5机械光闸,8组束镜,5衰减滤光轮和1线选择滤光轮为多参数共聚焦显微镜

 

声光可调滤光器 - 操作方法

简化的机械安装和数量级增加灵活性显著步骤是一个声光滤波器(AOTF)的实施情况。 基本上,一个AOTF是一种装置,使得所需的颜色来进行控制,以指向不同的方向,而颜色的其余部分直接通过AOTF中。 的AOTF是由一个晶体,通常TEO 2,SiO 2等或其它化合物具有类似性质。 该晶体是由一种机械波在几百MHz范围内通过机械换能器(术语“声波”指的是机械波,虽然频率没有达到我们所标记为可听见的声学)激发。 最重要的是,在该期望的光束被偏转的方向是固定的,并且不依赖于光的颜色。 和作为一个额外的好处,光的,应该在被请求的方向指向的量是可控的机械波的幅度。

在与(准直)的激光线的各种波长的,由“激光电池”的规定的照射下,AOTF使被拾起并针对所请求的方向上的充分强度的任何所需部分的任何线路。 因此能够真正同时选择多个行。 数量主要取决于电子设备的数量一个是准备投资。 体面的系统同时提供8行。

总体而言,AOTF完全取代了单晶的机械固定在上述所有的百叶窗,衰减器和行选择器。 行的任何组合是很容易选择的,当该激光电池提供总共8条线,组合的数量达到256 - 而不是与AOTF问题。 加:每个选定的线路是在强度无级控制。 在本质上,AOTF是一个“8通道激光调光器”。

工程师们可能会说,AOTF指示不同方向的两个偏振模。 这是完全正确的,但不损害概念。 激光器反正偏振光,因此光将始终指向所希望的方向。 垂直方向将保持空的,没有任何后果。

与传统的激光组合组合AOTF完全取代所有的光闸,衰减器和行选择器。徕卡首先介绍了AOTF的共聚焦显微镜系统于1992年。配备声光滤波器的第一个系统是徕卡TCS 4D,标志着徕卡在激光共聚焦显微镜光谱革命,终于在2007年四舍五入的白光激光徕卡TCS SPX的开始。

 2:声光滤波器(盒右侧)取代了传统的电池激光共聚焦照明所有的百叶窗,衰减器和行选择器。 任何输入AOTF的线路可以被抑制,减弱或用于在共聚焦显微镜使用完全传送。 由激光器发出的线的任何组合可以被组合(一个非​​常高的,虽然组合有限数量)。

 

AOTF - 免费额外的好处

感兴趣区域的扫描第一次成为可能引进AOTF共聚焦显微镜。徕卡TCS 4D是第一个AOBS共聚焦。在感兴趣区域的扫描模式下,激光被迅速切换(在几个像素,这取决于设置),以“漆”具有不同的颜色组合的激光照射任意或几何图案。
3:扫描感兴趣区域用不同的激光线或同一行的不同强度。 在逐行扫描中,照明政权在预设点根据预定义的模式改变。 的任意组合是可能的,在几乎任何图案,这是由手带图形光标绘制到一个预扫描图象。 当然,几何图案可被施加,以及(矩形,圆形,椭圆形...)。“零线”也是一个图案,并经常用于保护背景细胞在细胞培养物。 

除了明显的好处,即AOBS允许任何激光器组合,该特定样品中适合的荧光染料的组合物,它具有进一步的好处。 让我们假定该标本染色用两种不同的荧光染料,是一个非常强有​​力的和其他的相当弱。 在这里,无级亮度调整使得荧光发射,以便在类似的强度由调光激发的染料鲜艳,记录两者的荧光进行平衡。 这是很容易可以在网上,在成像过程中。 AOTF的控制速度快,不需要扫描进程停止。

通过无级亮度调节平衡的激励,不仅有利于对的荧光通道可比性,这也是一个有价值的工具,以提高荧光的分离。 许多染料显示在他们的发射光谱,导致了错误的染料被拾起在右声道长“尾巴”。 通过降低励磁到最低限度,分离可以提高(降低串扰)。

最后,集中选择线(和强度)之间的开关速度非常快 - 在几微秒;相比大约一秒钟为标准的机械过滤器的轮子。 这种快速开关允许照明政权(这在什么强度线)一行的扫描过程中被改变。 此功能是用来描绘出不同的照明颜色图案在样品上,所谓的“感兴趣区域”,不同的激光器是积极的。 它也可以用来“变黑”,其中没有信号要被记录的区域。 这样可以使样品活着后研究这些地区。 在这篇文章的开头图为利益,其中5种不同的参数设置是否在单次扫描得到应用,例如区域。