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奥林巴斯显微镜文物和畸变的反卷积分析

2014-03-08  发布者:admin 

 经过反卷积算法已被应用,还原图像可能包括明显的文物,如条纹,振铃,或不连续的细胞骨架染色。 在某些情况下,这些问题都涉及到数据表示,不会与不同的算法或软件程序包发生。 当加工参数配置不正确,对原始图像也可能出现伪影。 最后,文物往往不被计算引起的,而是由组织学,光学偏差,或电子噪音。 当试图诊断的神器之源,第一步是与反卷积图像仔细比较原始图像。

如果工件是在原始图像中可见,那么它必须由因素从上游的反褶积引起的。 通过调整原始图像的对比度和亮度,一些伪像可以显示,并不明显时第一眼。 如果神器不存在或检测不到的原始图像,然后反卷积的某些方面被牵连。 在后一种情况下,它可能是有用的各种算法(例如,逆滤波器对受约束的迭代算法)进行比较反卷积的结果。

点扩散函数的注意事项

点扩散函数(PSF)的质量是一个卷积算法的性能至关重要,应严加审查。 嘈杂的,畸变,或不正确缩放的点扩散函数将会对反褶积结果的不成比例的影响。 这是为迭代技术尤其如此,因为该点扩散函数被反复施加到计算中。 在所有情况下,模糊光在原始图像上的分布和程度,必须对点扩散函数相匹配。 如果不匹配的点扩散函数是利用,那么文物可能导致或恢复的质量可能会下降。

在许多商业反卷积软件包,用户可以选择任何一个理论或实证的点扩散函数的图像复原。 在一般情况下,结果是,如果一个经验点扩散函数采用更好,并且还有不优先使用的理论点扩散函数的几个重要的原因。 首先,尽管存在着良好的理论模型的点扩散函数,它们是不完美的模型,并进行了实证的点扩散函数包含在理论模型没有可用信息。 其次,在商业软件包提供了理论点扩散函数通常假设完美的轴向和旋转对称的,这意味着它可能无法正确​​地适应模糊在原始图像上的分布。 这个问题是在高分辨率最严重(例如,与具有数值孔径在1.2和1.4范围内的物镜),其中,在所述透镜组件或光学涂层小的制造变化可引起轻微的畸变中的点扩散函数的对称性。 一个理论点扩散函数不能反映这些镜头的具体变化和产量较差反褶积的结果。 此外,一个经验点扩散函数可有助于选择合适的物镜进行反卷积分析。

呈现在图1是一系列理论上生成的等高线图的共聚焦点扩散函数是逐步更深的名义焦点位置成水介质。 油浸物镜的利用率是假设,和点扩散函数的显著轴向传播的浸油和水,其与聚焦深​​度增加之间的不匹配的折射率的效果。 归属于在理论上模拟曲线仅这一个可变的点扩散函数的象差的复杂性说明了为什么点扩散函数的实验测量是准确占可能影响反褶积结果像差的优选手段。 图1(a)示出了无像差的共焦PSF在匹配指数介质,没有像差的存在。 点扩散函数的轴向程度明显增加的焦点位置(通过第1(e)图1(b))改变为更深入地沿着z轴,点扩展函数被移向物镜。(本文来源:奥林巴斯显微镜文物和畸变的反卷积分析

像差,很难检查复​​杂样品时,检测变得非常清楚检查从单一荧光珠产生的点扩展函数时。 因此,在购买一个昂贵的新的物镜之前,建议从几个物镜点扩散函数来获取和比较,以帮助选择系统与最理想的点扩散函数。经验点扩散函数的另一个好处是,它能够使显微镜来测量成像系统的性能。 也会发生点扩散函数采集过​​程中的实验过程中可能发生的许多潜在的问题,如舞台漂移,灯的闪烁,照相机噪声,折射率不匹配,和温度波动,而且更容易辨别。 因此,在实证的点扩散函数畸变建议如何改善显微镜拍摄的图像的质量。

当获得的经验点扩散函数,必须小心,以配合出现在原始图像畸变。 理想的情况下,无论是原始图像和点扩展函数应该是免费的像差,但是,这并不总是可能的。 如果主要的像差是存在于原始图像,那么他们应该(如果可能)由像差的点扩散函数匹配。 否则,反卷积图像可能包含错误或恢复不佳。 此外,如果该点扩散函数是喧闹的,当时的主要噪声将出现在反卷积图像。 为了减少噪音和消除轻微的畸变,许多软件包径向平均的点扩散函数或平均的几个荧光珠的图像来创建一个平滑的点扩散函数。 许多商业软件产品的另一个特点是,它们会自动插采样间隔的点扩散函数的相匹配的采样间隔把原始图像的。 如果不是这样,点扩散函数和原始图像必须在相同的采样间隔被收购。

当使用一个理论点扩散函数,点扩散函数的参数必须正确设置。 这些参数包括成像模态,数值孔径,出射光的波长,像素大小和z步长大小,并且可以显着地影响所得到的点扩散函数的大小和形状。 在一般情况下,随波长的增加而减小与数值孔径的点扩散函数的大小增加而增加。 像素大小和z步骤参数被用于相对于所述原始图像缩放的点扩散函数。

如果理论点扩散函数的大小和形状是不恰当的原始图像,则工件可导致对各种原因。 首先,该算法解释中的点扩散函数尺寸方面的采样间隔的图像。 第二,点扩散函数确定的体积的大小和形状从模糊的光被重新分配。 如果卷不对应模糊的图像中的真实分布,然后器物可以推出。 可能会发生这个错误,如果有错误缩放或像差的点扩散函数。 它也可以导致如果图像的“真正的点扩展函数”具有未由算法生成的点扩散函数相匹配的像差。

在某些情况下,使用的是理论点扩散函数时,更好的结果,可在点扩散函数是显然太大获得的。 一种可能的解释是,原始图像的真实点扩散函数是大于预期。 这可能发生,因为折射率的不匹配,从而导致球面像差和改变z轴缩放。 这两种现象加宽真正的点扩散函数在z方向上,使它更大,从而降低了物镜的有效数值孔径。如果这种情况下,怀疑是,研究者应该试图减去一个小的增​​量(例如,0.05)的理论点扩散函数的数值孔径。 在一些软件包,类似的结果可以通过将点扩散函数的z步长,以比实际的z步骤中获取的原始图像利用较小的获得。

正常情况下,点扩展函数的z步长应始终是相同的原始图像的z步骤。 此小心确保该点扩散函数的标度是合适的成像条件。 用经验点扩散函数,但是,有可能获得更细的z轴分辨率比原始图像中的点扩散函数。 应该提到,这招只有当该软件可以插采样间隔的图像,并使其对应的点扩散函数。

目前,大多数市售的反卷积软件包假定点扩散函数是恒定的所有点的对象,被称为空间不变性的性质。 光学显微镜通常满足这个假设,但其他的问题,如折射率梯度的样品材料或浸泡的不匹配和安装介质可以诱发空间变化的点扩散函数,尤其是在厚厚的标本。 目前,所有的商业软件包假设空间不变性,但在未来(由于迅速增长的计算机处理速度),也可能是可行的,通过图像变化的点扩散函数。 它也可能成为可能通过采用透射光图像映射折射率梯度的试样,并相应调整点扩散函数来校正点扩散函数的空间变化。

球差

球面像差是点扩散函数差的臭名昭著的形式,是最难以对付的。 该工件包括在点扩散函数,它们都增大了的点扩散函数的喇叭形,并降低其亮度的形状的轴向不对称性。 在各种形式的光学显微镜的一个共同的问题,球面像差是退化的分辨率和信号损耗在两个共焦和广角调查的主要原因之一。 检测球面像差可以通过集中上下贯通的试样,在离焦的环的上方和下方的明亮的荧光点状的细节(如示于图2)观察的不对称性来实现。 或者,工件可以在所获取的图像堆栈(在XZ或YZ的突起)通过在模糊的光的周围的荧光结构的喇叭形搜寻在轴向不对称性检测。 第三种技术检测球面像差的有用的是从一种荧光珠安装类似的光学条件下的试样根据获得的点扩展函数的图像,并且搜索轴不对称的点扩散函数的喇叭形。

如果在观察的标本是比较厚的(大于10微米),球面像差可逐渐成像发生在试样内部更深层次的诱导。 因此,直属盖玻片表面贴装珠可能不能揭示球面像差在这种情​​况下。 一个建议的补救措施是从靠近试样中的所希望的图像平面通过第一暴露试样的荧光珠的溶液用珠获得的点扩展函数的图像。 然而,这点扩散函数不应该用于反褶积,因为从组织散射会使点扩散函数喧闹得多,在大多数情况下。

球面像差是在成像系统中的光学路径的缺陷所致。 它可以是由于在物镜的缺陷,但更经常的像差的发生是由于折射率的光学介质直接相邻的物镜前透镜元件的不匹配。 现代的物镜通常被设计来校正和/或减少的球面像差,只有当他们被用来与盖玻片玻璃的适当的类型和厚度,以及适当的浸泡和安装介质。 这些材料的光学特性是至关重要的光通过物镜(和显微镜光学系列的其余部分)的正确聚焦。(本文来源:奥林巴斯显微镜文物和畸变的反卷积分析

在图2(牛肺动脉血管内皮细胞)呈现的图像被收购与宽视场荧光成像相似的条件下,除了浸油的折射率的变化的系统。 将原始图像(最大强度投影),如图2(a)所示的具有1.514的折射率的浸没油被获取,并且是自由可观的球面像差。 图2(b)是反卷积后的相同图像。 类似的细胞,具有较高的折射率(1.524)的油状物,并表现出显著球面像差获取的,如图2(c)所示。 周围的细胞周围的点的衍射环是差的表现。 以下通过反复的约束反褶积(图2(d)),恢复原始图像的一个水平行的一个子体积的边缘引入(以箭头的右侧)。此工件不存在于原始图像(图2(c)),并且,因此,不通过成像系统所造成的。

相当普遍的生物学调查,浸泡和安装介质的折射率不相同,甚至接近。 在这些情况下,可能会发生两种扭曲球面像差和z轴距离的缩放比例。 这两种现象取决于震源深度,所以在不同深度的功能将展示不同量的球面像差和z轴比例文物。 虽然z轴缩放不会影响分辨率或信号强度,但它代表z轴的距离测量的线性缩放由不匹配的介质的折射率之比。 为了校正这种扭曲,Z-距离可以由标量补偿系数相乘,有些软件包提供此功能。 在另一方面,球面像差是难以纠正,因此非常诱人忽视,但是也有少量的注意这个问题可以产生的图像质量有很大的提高,尤其是在弱光条件下,如在活细胞。

最近,一些研究已针对数位与球差的点扩散函数解卷积校正球面像差。 这需要解卷积软件不能自动进行预处理的点扩展函数以使其轴向对称。 如果是这种情况,那么显微镜能精确地通过具有在手“家庭”的经验点扩散函数不同程度的球面像差,并选择最合适的点扩散函数的匹配在图像和点扩散函数的像差给成像条件。 这种类型的计算修正的可能恢复丢失的分辨率在一定程度上,但它不会恢复丢失的信号。 因此,为了校正球面像差的最佳机制是通过光学方法预先消除神器。

有很多种由显微镜来校正球面像差的光学技术和技巧。 一对标本浸泡在水溶液中最常见的应用是浸油的物镜,它可以直接进入安装介质中无盖玻片。 因为浸渍和安装介质是相同的,没有折射率不匹配是可能的。 然而,失真仍然可以发生,因为试样和沉浸介质之间或者由于试样本身内的折射率的梯度折射率失配。 另一种方法涉及调节浸没介质的折射率,以补偿所述安装介质的折射率。 如果试样被安装在低折射率比玻璃的介质(例如,甘油或水基介质),则增加了浸没介质的折射率,减少或消除小程度的球面像差。 用具有1.4数值孔径的物镜时,该技术使一个相对无像差的成像条件达约10至15微米的盖玻片的有限焦点深度和试样安装在甘油。 几个商业供应商现在提供浸没介质具有规定的折射率,可以混合以任何期望的中间值。

另一种常用的方法是使用一个专门校正物镜,如高数值孔径的水浸泡即日起接受报名与盖下滑标本的物镜。这些物镜有一个校正彩色,使补偿透镜元件和试样之间的折射率的变化。 虽然他们都非常昂贵(目前约10,000美元),水浸的物镜可以提供成像深度大于15微米成厚片,当以消除球面像差的唯一方法。 对这些物镜的修正衣领不应该混淆与较便宜的暗场的物镜找到了可变光圈校正衣领。

数字图像采样间隔

适当的采样间隔在x,y和z方向上是不错的解卷积结果重要。 这是标准的做法,以获取样本可分辨的空间频率的两倍,这符合奈奎斯特采样定理(每个元素解析两个样本都需要精确的检测信号)。 然而,奈奎斯特采样频率是真的只是需要一个离散采样机制取得的实际信号的合理近似最小。 更高的采样频率产生卓越的修复,应用三维算法时尤其如此。 与此相反,二维去模糊算法最有效地工作,当取样率是较低的在z方向上(当光学部之间的间距等于或大于分辨的元素)。

荧光显微镜中,可分辨的元素通常使用的瑞利准则来定义。 例如,与染料FITC(在520纳米的发射峰),1.4数值孔径的油浸物镜,并用1.51的折射率(最匹配的光学玻璃)的安装/浸没介质,所述解析单元尺寸为227纳米的(根据瑞利准则)的xy平面和801纳米的在z方向上。 样品在这些条件下的奈奎斯特频率,采样间隔应为这个值的一半,或在xy平面和0.4微米的在z方向上约0.114微米。 提供在图像恢复的最佳效果,取样在一个较小的间隔建议,也许0.07微米的在xy平面和0.2微米的在z方向上,在相同的条件下。

应当指出,这些准则是最佳设置,并应通过考虑所研究的特定制剂的平衡。 作为一个例子,荧光信号可以是如此之低(常出现在活细胞的实验)的CCD的像素的像素合并这是必需的,或者可以如此之快,以至于没有足够的时间,以在z方向上精细样品发生的事件。 在这种情况下,最理想的采样间隔是必需的。 幸运的是,修复算法仍然可以工作相当会在这些条件下,虽然在正则有些变化可能是必要的,一些算法。

振铃和边缘文物

振铃是在去模糊或反演技术的应用主要是遇到了一个神器,但它也可能发生与迭代法。 该工件具有深色和浅色的涟漪周围的图像的明亮的外观特征,如图3所示,并且可以既在z方向上和在xy平面内发生。 当在z方向上可视化,振铃出现在更深的z截面的阴影,概述荧光结构。

振铃的源通常是转化的不连续信号进入或离开傅立叶空间。 一些相关的问题可以产生信号的不连续性,因此有助于振铃。 不连续性可能发生在图像的边缘或图像的子体积的(图2)或者甚至在明亮的特征的边缘(图3)。 不连续性的另一来源是将原始图像或点扩散函数,在嘈杂的图像或点扩散函数和点扩散函数的形状,是不恰当的图像的空间采样不足。

在图3所示的每个图像是从图像的三维堆叠的单个代表性的光学部分,并示出了从固定部金字塔细胞树突。 的原始图象被显示在图3(a)所示,而图3(b)是同一图象场以下迭代解卷积。 在反卷积图像,显著振铃发生(约荧光树枝状暗轮廓),最有可能的,因为球面像差中的原始图像,它是不是在点扩散函数匹配。 在相同的图像,噪声放大显示为背景的斑点。

为了避免振铃最好的办法是确保傅立叶适当开窗变换。 尽管一些商业软件包都没有解决这个问题,它正变得越来越常见于高端的算法实现。 振铃也可避免使用更精细的采样间隔中的图像或点扩散函数,通过平滑的图像或点扩散函数,以在与这些图像的点扩散函数精心匹配的像差,或通过调整该点的传播函数的参数。

振铃的图像的边缘可以通过简单地去除边缘被抑制。 许多算法消除围绕整个图像8至10像素或飞机保护带 。该操作需要空白空间的上方和下方的荧光结构的图像中要保留。 空白空间是不可取的,因为从上面和下面的对象模糊的光可被重新分配,并有助于该信号为对象。 然而,空白空间可以人工创建的,而不保真度的损失,通过将内插平面到图像堆栈的顶部和底部。 在计算机的存储器和处理时间所得的成本可以通过在傅立叶空间中进行的内插被最小化。

振铃子卷的边缘是一个类似的问题(见图2)。 通常情况下,亚体重叠量可提高到取出神器。 或者,如果足够的随机存取存储器(RAM)被安装,则整个图像可以被处理为一个单一的体积,以避免伪像。

噪声放大和过度平滑

如前面所讨论的,噪声放大是由去​​模糊和反演算法一个工件。 神器也会发生与迭代算法的重复卷积运算引入的高频噪声。 噪声图像反褶积表现为图像,往往是在每一个平面不变的,是特别引人注目的背景区域的显着斑点。 它通常可以通过应用平滑滤波器或一个正规化( 粗糙度 )滤波器抑制。 在过度的噪音是在一个反褶积图像中观察到的情况下,然后朝一个补救措施的第一步是确保点扩散函数为噪音尽可能免费。 接着,检查算法过滤器和尝试优化他们的可调参数,使图像功能比分辨率限制的维持,而较小的变化被抑制。 不要增加平滑太多,因为过度的平滑特性会降低图像的分辨率和对比度。

消失和爆炸特性

也许是反褶积的最讨厌的文物是非常暗淡的功能明显损失或非常明亮的特点炸毁 (开花或对比度爆炸)。 这些工件不同于过多引起的平滑的,因为它们影响到特定的功能(图4),相对于该图像作为一个整体。 在这种情况下,作出尝试来比较不同的算法对工件的外观(如逆滤波器对迭代算法,或古典与统计算法)的影响。如果神器只出现一个单一的算法,那么原因可能是不稳定的算法或算法对特定样品类型的特定效果。 在其中的影响发生与几种算法的情况下,则有多种可能的来源。 当图像小,昏暗的特征正在消失,其原因往往是非负性和平滑滤波器的组合。 这是可能的,如果有过多的噪音图像或点扩散函数发生,或者如果情况有利于振铃。 噪声和振铃可诱导的负像素值,以使非负性约束被调用和功能被分散。 如果发生这种情况,平滑滤波器可以移除或平滑许多剩余的片段,产生该特征的消失。 工件的严重性可以补偿(或者它可以完全被消除),通过减少图像中的噪声和点扩散函数(具有更长的曝光时间,或通过平均),通过消除点扩散函数的不匹配,并通过适当调节平滑筛选。

图4示出相似于一个先前显示(图3)的光学部分的放大的细节。 三个扩印被从原始图像拍摄之前,反卷积(图4(a),上游),以及反卷积得到越来越多的迭代之后(250和300的迭代;图4(b)和4(c))。 一个小的特征,由箭头表示,消失的迭代解卷积的结果。 可避免的点扩散函数的正确应用这种类型的神器。

当明亮的特点是扩大一个反褶积的图像,则源可能是像素的饱和度。 包含一个显著一些明亮的特点RAW图像都会有这样的亮度还原过程中进一步扩展。 然而,在非常明亮的特性,反卷积算法可导致像素值超过在给定的位深度的最高值表示的。 实际上,这些像素将饱和 ,将被分配的最大值。 那么该功能将变得非常明亮,会出现扁平化,并在规模可能扩大。 神器可避免利用摄像头和软件,将允许更大的位深度和一种算法,在内部存储数据为浮点数。 使用这些技术扩展计算机存储器的要求,但可防止这样的伪影的发生。

标本依赖文物

科学文献的成熟与一些标本类型,但不与他人观察到反褶积文物的报道。 特别是,一些研究者已经报道,丝状结构分散的一类卷积算法,但不与另一种。 如果一个结构变化观察,那么它始终是最好比较反褶积和原始图像。 如果仔细观察发现,反褶积后的结构特征明显不会出现在原始图像,然后点扩散函数的参数进行检查,以确定其正确的设置,点扩散函数也应审查的噪音。 如果问题仍然存在,那么整个算法是嫌疑人,不同的算法对神器的外观效果应该比较。 此程序将验证由一个给定的算法的特定样品是否恢复到令人满意的程度。

当一个明显的神器是可见的两个反褶积和RAW图像,然后试样制备或光学像差的某些方面被牵连。 特别是,免疫荧光染色往往是不连续的沿细胞骨架丝(肌动蛋白丝,微管和中间丝)。 一些消息来源可以有助于这一问题。 之一是细胞骨架相关蛋白可能掩盖细胞骨架细丝,使抗体可访问性是沿灯丝变量。 另一个来源是在免疫细胞化学使用的固定剂,它往往不如实地保留丝状结构。 例如,微管可在甲醛或甲醇固定片段。 一个更忠实的固定剂如戊二醛可以采用,但在抗原性为代价的。 最佳的固定方法是在各种文献来源和教科书中描述。

标本相关文物的一个常见来源源于折射率梯度的标本本身。 在试样这些原因透镜效应光之前到达物镜,因此,可能会扭曲的形象。 一些标本(例如,胚胎和厚组织)有卵黄颗粒或其他细胞器,其折射率显著不同于周围的细胞质。 此外,可能存在折射率梯度所造成的安装介质的均相混合的装试样。 这件神器是特别容易,如果试样安装在其以前没有浸泡的媒介。 计算方法为纠正这种异质性可能提供在未来,但它始终是一个很好的做法彻底浸泡标本中被很好地匹配到试样本身的折射率的安装介质,以尽量减少这些文物。 作为补充措施,这是明智的调整浸入介质的折射率(如果可能),以补偿该安装介质。

水平线和垂直线

大概解卷积显微术的最常见的伪影是在x,y和z轴的水平线和垂直线。 在许多情况下,这些线路可以在当它被仔细研究的原始图像被观察到的,这表明它们不是反卷积操作的结果,而是由算法被增强。 线或条带也可能来自于子卷,振铃形式之间的界限边缘的文物。 在任何情况下,这样的工件都难以误认为是生物结构,可以很容易除去。

在xy平面水平或垂直的线条往往是由于CCD传感器用来记录影像柱缺陷 。 如果在芯片的读出寄存器中的一个像素的缺陷,或者如果传递到该像素是低效率的,那么结果可能显示为垂直于所读取的寄存器的一行。 这条线,然后由卷积运算增强。 如这个问题通常可以用一台调遣的操作来校正,也称为阴影背景校正,并且被包括在大多数反卷积软件包。

在XZ或YZ的视图(称为Z-线 )观察到的垂直线是由于变化的各个像素的响应特性。 每个像素具有一个稍微不同的增益和其邻国的偏移。 在极端情况下,也有不好的像素 ,其光子响应从他们的邻居显著偏离。 通常,在相同的像素系统从其邻居偏离整个堆栈的图像,剩下的z线。 这个问题可以通过平场作业或由搜索出这些匪徒,并将其与自己的近邻均值代替专门的坏像素例程进行修正。

与此相反,在XZ或YZ意见水平线代表在图像堆栈是比他们的邻居均匀明亮的整个平面。 这个问题是由于在该照明系统的波动。 在数据收集过程中的弧光灯的功率输出偏离的情况,那么这种变化将被记录在平面之间的荧光强度的系统性差异。 此外,电弧在灯可以漫步在电极的表面上,诱导时间依赖性的空间不均匀性在试样的照明。 这些活动将通过反褶积会加重,但可在原始图像进行观察。 这两个问题通常可以通过更换弧光灯被最小化。

如果灯的波动仍然是,即使有新的弧光灯,然后直接测量弧光灯功率波动的结合的总的像素强度的平面由平面可被用来校正应用到原始图像中的多项式拟合的一个问题。 这种类型的校正的某种形式被包括在大多数市售的反卷积包。 第二个问题,由于电弧徘徊变化的照明图案,难以校正由图像处理,但是可以通过安装弧光灯和显微镜垂直照明器之间的光纤加扰器来消除。