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奥林巴斯显微镜,过滤器黑白显微摄影

2014-03-05  发布者:admin 

 在黑白摄影通过显微镜,过滤器主要用于控制在电影拍摄最终图像的对比度。 这是高度分化的,相对于从生物污渍彩色元素标本被翻译成灰色的黑白胶片的色调,常常会出现有相同的亮度。 当这种情况发生时,重要的标本细节可以通过缺乏对比度会丢失。 过滤技术的黑白电影显著有别于那些颜色显微摄影使用。

要使用黑白显微更好的图像样本,过滤器通常采用有选择地吸收一种或几种颜色,使用具有相同的灵敏度,以多个渍色全色胶片时尤其如此。 许多染色生物标本表现出很淡的颜色背景明亮(使用透射明视场光学显微镜),记录在黑白胶片拍摄时,将出现一个白色的背景为浅灰色色调。 以提高对比度,彩色滤光器被添加到吸收染色的样品颜色的显微镜光路中,将其定为暗灰色。 对比度可以以这种方式通过选择性地选择吸收不同量的污渍颜色的过滤器进行调整。 这个概念进行了探讨与沾有含番红为O(渍核,染色体,木质化和cutinized细胞壁红色),固绿(渍四倍混合染色图1给出的显微照片,它说明了一个薄的马铃薯 (土豆)节细胞质和纤维素的细胞壁绿色),结晶紫(渍淀粉粒紫色),和橙G(渍嗜酸性细胞质和细胞壁黄色变为绿色)。

在图1所示的显微照片(a)采取了与明照明,并使用富士正片64T透明色(反转)膜中性密度滤光片。 此图片显示的淀粉粒与番红O和结晶紫染色主要块茎矩阵,而标本的其余部分由纤维素和绿色的染色与固绿和橙G。图1(b)显示了相同的拍摄现场使用细胞壁柯达的T-100最大(连续色调全色黑与白负片),但与柯达雷登25号红色滤光片(见表2)插入显微镜光路。 试样的红色区域由过滤器,其中还介绍了在被染成蓝色和绿色的标本细节反差太大降低对比度。

柯达数字47B蓝色滤光片置于显微镜的光路为记录在图1(c)中所示的显微照片。 有了这个过滤器,淀粉粒已经获得增强的对比度,但标本的绿化面积正丧失对比度和细节。 图1(d)示出了当一个柯达数字滤波器58(绿色)被置于光路中的检体。 时相比,图1(b)该绿色滤波器增加了淀粉颗粒的对比度,但会降低在染色用绿色染料区域的对比度。 整体对比度进行优化,在图1(d)给出的显微照片。

作为一般规则,采用彩色滤光片的黑白显微摄影时,利用过滤器是免费赠送给标本染色色(它们吸收了大部分的污点传播的主要波长),以最大限度地提高最终图像的对比度量。 为了达到对比中等水平,使用过滤器,只有部分吸收最感兴趣的功能显示的颜色。 最后,为了降低反差降至最低,使用有颜色的那些相同的试样的过滤器。 过滤器的组合可以被用来提高在标本染色与一个以上的色彩细节的对比度。

吸收特性的生物染色剂
污点 可见光吸收范围
Acid Fuchsin 530-560
Aniline Blue 550-620
Azure B 580+
Azure C 580-640
Basic Fuchsin 520-570
Brilliant Cresyl Blue 550+
Carmine 500-570
Congo Red 400-560
Crystal Violet 550-610
Darrow Red 450-550
Eosin Y 490-530
Erythrosin B 510-540
Ethyl Eosin 530-550
Fast Green 560+
Giemsa 500+
Light Green SF 590+
Luxol Fast Blue 500-640
Methyl Green 560+
Methylene Blue 590+
Neutral Red 480-570
Nigrosin 450+
Nuclear Fast Red 460-550
Orange G 450-510
Orecin 500-620
Phloxine B 510-560
Prussian Blue 560+
Pyronin B 510-560
Saffron 350-480
Safranin O 470-550
Sudan IV 470-580
Sudan Red 450-590
Tartazine 400-460
Toluidine Blue 560+
Trypan Blue 500+
Wright's 500+
表1

表1可以被看作是一个条形图的汇编较常见的生物污垢的吸收光谱。

大多数生物标本缺乏足够的颜色和对比度使用明场照明,以容易地成像在光学显微镜下。 这些样品通常不吸收可见光任何大的程度(它们不是好的振幅标本),并且可以被看作是一个粗略轮廓的一些内部细节仅当聚光镜孔径尺寸减小了,常常引入光学构件的点。 为了解决这个问题,经常显微镜治疗生物细胞和组织反应性的有机染料会选择性地染色和颜色的生物体系结构的各个部分是。 因为背景往往会出现白色或非常浅的灰色在明显微镜,染色的组织会出现彩色的,叠加在浅色背景。 这是常常足以使感兴趣的可见的细节和有足够的对比度,以提供良好的显微照片。

在许多情况下,不同颜色的两个或更多的污渍进行组合,以帮助该躺靠在一起的蜂窝单元之间区分,产生了颜色对比度,从另外一个分开的一个元素。 例如,细胞的细胞核可以用苏木精,从缺口洋苏木,其选择性地结合到染色质中提取的天然无色化合物。 为了提供此相反,苏木往往是结合曙红,红色的荧光染料染色的各种细胞质结构。 这两个污渍的结合使细胞的细胞核染色被染成红色深蓝色,并具有细胞质成分。

程序用于染色生物体组织范围从单个细胞与染料非常简单的混合物,以消耗大量的时间和材料复杂的多步骤的组织切片工序。 涂片通常可以通过简单地丢弃染色和固色剂的混合物到含有细胞进行检查培养管被污染。组织切片是更困难的,并且需要几个固定剂和被放置在显微镜载玻片上,并通过染色和洗涤液的色域运行之前,切片的步骤。

大多数的污渍是可以得到自然的或在实验室中被合成复杂的杂环有机染料。 染料的特征在于它们的紫外和可见吸收光谱,这是用来从另一个区分1污点。 一个典型的可见光吸收谱的三苯基甲烷染料坚牢绿示于图2。 阿强吸收带集中在620纳米过滤掉大部分的红色光波只留下绿色和蓝色的。 快绿是用来选择性地染色胶原蛋白,粘液,和植物细胞壁带负电荷的(阴离子)染料,渲染这些结构蓝绿色到深绿色。 显然,使用有机染料着色的生物组织时,染色的吸收特性,必须加以考虑。

污垢选择性是由染料分子相对于它们与细胞成分相互作用的化学和电子性质来确定。 具有净正电荷的水溶液或缓冲溶液的污渍会选择性地附着或结合到带负电荷的生物结构。 亲水性污渍将趋于弄脏水合生物组件,例如蛋白质和核酸的外部。 污渍与疏水特性将分割成的膜,脂质和蛋白质的内部。 生物组织选择的污渍时,这些属性应该被铭记。

常见的生物污垢以及它们的可见光吸收特性的汇编在表1中。 使用显微镜染色生物组织的染料具有广泛的色彩范围,从深蓝色到明亮的红色,用中间色也可无数。 检查表后,将成为明显的是,许多染料具有相似的光谱特性,并在乍看之下,这似乎是相似的染料可以互换使用染色生物标本。 在许多情况下,类似的染料可被取代的无不良影响,但在某些情况下,替代染料可在不可预见的方式,得到不理想的结果与其它染料或生物结构进行交互。 这是常见的,其中的染料的化学和物理性质,必须精细地调谐并匹配彼此复杂污垢的混合物。通常,取代基的一种染料的另一个显着地改变了混合物的染色性能。

如上面所提到的,许多染料具有相似的颜色和光谱性能。 然而,在他们的可见吸收光谱仔细检查,出现类似的染料往往显着变化在它们的光吸收曲线。 作为一个例子,我们可以比较它们似乎是相同或几乎相同的光谱特征三个红色染料:达罗红,番红O和苏丹红IV。 对三种染料的可见光吸收光谱示于图3。 虽然所有三种染料强烈吸收在430至580纳米(蓝绿色)区和发射红色波长的光,其主要的吸收最大值高达40毫微米不同。 光谱宽度和波长吸收分布也不同遍及三个光谱。 达罗红色的强烈吸收波长在400到460纳米范围内,但番红O有少许吸收在这个区域。 番红澳的吸收光谱也移动20纳米朝着在580-600纳米的区域更长的波长。

三种染料的电子,化学和物理性质发生变化比的吸收谱,甚至更多。 番红O是非常易溶于水,但在其它两种染料是仅微溶于水或缓冲溶液。 此外,达罗红和番红O为阳离子染料(他们有一个净正电荷),而苏丹IV是不带电和中性。 通过三种染料有针对性的生物结构也各不相同。 达罗红是专门用于含有核酸RNA和DNA,番红Ø污渍核和细胞壁的组件结构,以及苏丹IV是选择性的脂质和存在于细胞和组织中的脂肪物质。 考虑到这些事实考虑,很明显,这三个染料是不可互换的,并可能产生混乱,如果他们在与其他染料的混合物相互替代。

在黑色和白色显微图像对比度优化需要仔细调整可见光穿过样品,并在胶片上乳液。 为了提供试样的元素和背景之间的适当的视觉差别,两种染料和彩色滤光片的可见光光谱特性的工作知识是至关重要的。 常见的生物污渍吸收光谱发表在各种来源,但有两个最好的作品都是污渍,染料和指标Sigma-Aldrich公司手册HJ康恩的生物染色剂 。 表1包含了最常用的生物污垢和有用的可见光透过率为每个染料的光谱范围的列表。

彩色滤光片可从玻璃支架或明胶正方形的形式专业摄影的供应商和显微镜制造商。 最流行 ​​的一系列的过滤器黑白显微摄影是柯达雷登明胶滤镜,这是索引与一个标准的编号系统(见表2)。 这些过滤器是非常适合与大量的有机染料可用,每一个都可以被精确地标准化与染料的每单位面积的存在量临界显微摄影。 由其他制造商生产的过滤器可以被引用到柯达的编号系统,建立等效的过滤性能。

在雷登过滤器是由明胶薄膜混合适当的染料和投射到光学级玻璃板,然后让其变硬。 硬化膜从玻璃板剥离,并涂有一薄层清漆的保护。 雷登过滤器很容易修剪用剪刀来允许修改放置在显微镜滤光片架。 虽然薄漆涂层能提供一些保护脆弱的过滤器,他们应该小心握住的角落,以避免磨损和污垢和油脂从皮肤上堆积处理。 过滤器也应受到保护,用玻璃过滤器热,从由显微镜灯产生过多的热量。 持续暴露于热过度延长的时间期间可引起筛选褪色。 雷登过滤器可以用驼毛刷和压缩空气进行清洁,但不应该放置在溶剂或水,以避免肿胀直接接触。

过滤器可以被放置在多个点在显微镜的光路。 许多现代显微镜具有定位在灯箱与底座之间的载波,将持有数的过滤器。 较旧的显微镜往往正好位于台下聚光器下方的过滤器载体。 避免将明胶滤光片上的显微镜光端口或近共轭平面(近场光阑或试样),以防止划痕和其它瑕疵从被聚焦在与场光阑叶片试件的平面上的任意点。

当过滤器被添加到该光路中,胶片的曝光时间必须调整(通常是增加),由过滤器,以补偿光的吸收。 每个过滤器都有一个使用该过滤器时(见表2)作为一个粗略的指南,曝光调整指定的过滤因子 。 各种条件下一起工作以影响对曝光的影响由给定的过滤器,包括该膜的光谱灵敏度,光源的颜色温度,试样和污垢的可见吸收光谱。

对于任何给定的过滤器的过滤因子能够而且应该通过实验来确定。 选择一个标本,有一个大面积的中性灰色的背景,并采取几个测试曝光无过滤器的地方。 这是明智的支架显微照片整个实验过程。 下一步,将过滤器中的光路,并作出一系列曝光,在三分之一提高到二分之一光圈为单位,通过更多地接触两到四站,取决于过滤器的密度。 选择最佳的显微照片后,比较的曝光数据,并确定从两次曝光产生相等的密度之间的曝光时间的差的滤波系数。

因为自动摄像系统将弥补增加的密度,当过滤器被放置在光路中,通常不需要过滤因子暴露加法。 然而,在许多情况下,在光电倍增管或光电二极管可以测量入射光强度的相机光谱感光度的细微差别可能导致不正确的风险。 深色的过滤器可能会略有取代显微镜焦点,由于物镜的光学特性,所以仔细添加过滤器的光路后,检查重点。 始终目视检查的最终显微照片和手动执行任何必要的调整。

干涉滤光器也可以被利用,以提高在黑白显微摄影反差。 这些过滤器使用多个蒸发薄层金属合金的光学级玻璃制成,高度精确的相对光谱透射和吸收特性。 干涉滤光器由波长带所发送的两个中心和宽度指定。 它们是商业上可从光学元件供应商或从显微镜的制造商。

过滤器和透光率值 
黑与白显微摄影
过滤器 透光率 
超过10%
过滤因子 
(光圈值)
3(浅黄色) 450 + 1.5倍
8(黄色) 470 + 1.5倍
9(深黄色) 480 + 3
11(黄绿色) 470-540 3
12(深黄) 510 + 2倍
15(深黄) 520 + 2倍
16(桔黄色) 520 + 2倍
18A(不透明的玻璃) 320-390 -
21(橙色) 540 + -
22(深橙色) 560 + 2.5倍
23A(淡红色) 570 + -
24(红色) 580 + -
25(红色) 590 + 3X
26(红色) 600 + -
29(深红色) 610 + 7.5倍
32(品红色) 320-500&600 + -
33(品红色) 440-460&620 + -
34A(紫色) 320-330,410-480&630 + 6X
38A(蓝色) 360-570 -
39(蓝色) 310-480 -
44(浅蓝绿色) 440-530 -
44A(浅蓝绿色) 430-550 15倍
45 450-510 15倍
47(蓝色) 400-500 15倍
47A(浅蓝色) 380-520 10倍
47B(深蓝色) 400-470 -
57 480-580 -
58(绿色) 500-580 10倍
61(深绿色) 500-570 10倍
64 440-560 -
70(暗红色) 660 + -
74(深绿色) 520-540 -
89B(不透明) 700 +(红外线) -
90(暗灰琥珀) 560-610&680 + -
92(红色) 630 + -
96(中性) 710 +(红外线) -
98(蓝色) 400-470 -
99(黄-绿) 530-560 -
102(黄绿色) 470 + -
106(琥珀色) 520 + -
表2

表2可以被看作是一个柱状图的编制较柯达雷登过滤器用于黑白摄影的传输特性。

可供选择的过滤器和污渍为黑白显微摄影的目的,在可见光光谱可分为三个主要区域,这在于在400至700纳米之间的波长范围内。 400和500纳米之间的波长时,一起观看视觉上显示为蓝色的光。 同样地,500和600纳米之间的波长呈现绿色,而这些600和700纳米之间显示为红色。 能吸收400至500纳米之间的所有波长的染料将通过仅较长的波长500和700纳米(绿色和红色光)之间,且会出现黄色,这是由混合的绿光和红光等分得到的初级减色。 如果染料400和500纳米之间的光透射和吸收光的波长较长(500至700纳米),那么它会出现蓝色。(本文来源:奥林巴斯显微镜,过滤器黑白显微摄影

作为一个例子,我们将研究刚果红(见表1),具有很强的吸收区域400和560纳米之间的吸收光谱。 蓝灯波长400至500纳米的下降是由刚果红吸收,因为是摆在500和560纳米之间的绿光波长。 560和700纳米之间只有较长的波长是由染料传递的,所以染料出现视觉上为红色。 甲苯胺蓝和台盼蓝两个发射蓝色波长和吸收更长波长的光,然而两种染料出现有稍微不同的色彩对人的眼睛。 这是因为台盼蓝吸收高于500纳米波长的一切,而甲苯胺蓝只吸收上述560纳米波长的那些,并通过绿色波长的区域500和560纳米之间。 因此,台盼蓝出现了深刻,丰富的蓝色,而甲苯胺蓝似乎在视觉上是一个蓝绿色。 在普通染料的可见光吸收光谱的差异(见表1)允许显微镜有很大的自由度去选择生物污渍时,选择合适的光谱范围。

过滤器相同的方式运作,相对于可见光的染料。 柯达数字滤波器38A发射360和570纳米之间的波长,涵盖了蓝色和绿色。 类似的过滤器,柯达数39,也是一个蓝色的过滤器,但传输或通过310和480纳米之间的波长。像台盼蓝和甲苯胺蓝,这两个过滤器通过光略有不同的色调。 该传输所有的2光谱区域或大部分,但是阻止三分之一(例如柯达39滤波器)滤波器通常被称为减去滤波器。 数字滤波器39有时也被称为减蓝滤光器,因为它是能够从可见光光谱阻止或减,蓝色波长的光。 以类似的方式,一个数字滤波器32显示品红的眼睛,并且被称为减去绿色,因为它吸收的绿色光在500至600纳米的区域。 32号过滤器在320〜500和600 +纳米范围,这加在一起,产生的颜色洋红色透射蓝光和红光。

当配置在显微镜对染色标本的黑白显微摄影,可以很方便地指无论在染色中使用的染料和用于控制对比度的滤光片的可见吸收光谱。 图4示出了一系列的过滤器用于控制与染料碱性品红(图4(a)),其强烈地吸收在520至570纳米波段的光,并出现红品红到眼睛的对比度。 碱性品红的吸收光谱表明,吸收了蓝色波长在这一地区的一部分(但不是全部)460和500纳米之间的肩膀。 这肩部负责轻微的红色色调出现在偏离真正的品红色染料。

对比从沾满碱性品红生物标本制作显微照片将取决于过滤器的选择。 一种过滤器,是相辅相成的染料将吸收所有的染料发射的波长或大部分。 这种效应被认为是在图4(b)如碱性品红的吸收光谱和柯达数58过滤器叠加。 350和500纳米和红色波长大于600纳米之间的蓝光波长是由过滤器吸收,对黑白胶片拍摄,得到的显微照片对比量最大时变暗染色区域。

当使用过滤器,其具有透射率范围比染色的吸收区域更宽,如图4(C)发生的污垢较少变黑。 黄色号码12柯达滤波器,其传输所有可见光波长大于500纳米,的吸收光谱叠加在碱性品红频谱如图4(c)所示。 该过滤器的剪辑部分在450到510纳米区域的染料的波长,产生的所得显微照片对比适量。

污渍的极小变黑可以通过选择在同一个区域吸收光的染料的滤波器来实现。 柯达47B滤波器具有一个可见吸收光谱中波长分配到碱性品红(图4(d))类似,并且将产生的显微照片以比数12和58的过滤器的对比度以下。 其他污渍可以比作以微调黑白显微摄影显微镜照明器以类似的方式。

比较染色/过滤器组合黑白显微照片是理解过滤的显微摄影的概念有帮助的。 如图5所示,有两个例子,其中样品的对比度显着,通过使用互补滤波器的增加。 图5(a)和(b)是染色的人回肠(肠)组织未经过滤器截取的显微照片(图5(a))和与该吸收大部分的染料颜色的(图5(b))的过滤器。 在这种情况下,污垢是非常浅的,并且需要一些调整,以允许所述组织可以从背景中区分。 由滤波器产生的对比度增加有助于试样站出来对灰色背景由发黑试样颜色而不显著影响的背景。 在图5的(c​​)和(d)的显微照片是使用过滤器,以促进标本对比度的另一个例子。 海星睾丸的染色薄款(图5(c))变黑(图5(d))时,免费的过滤器被添加到显微镜的光路。 昏暗的污点有助于揭示细胞间结构,这些染色切片的细节,但必须在过滤器选择的做法,以避免反差太大。

过滤器还可以用于增强对比度并在标本染色用多于一种颜色提供细节。 在图6所示的显微照片(a)和(b)示出的薄人肺组织患支气管肺炎的部分。 未经过滤(图6(a)),背景是暗并往往掩盖重要标本细节在肺组织。 用适当的过滤(图6(b)),背景,这是不重要的,是减轻和含有的最重要的信息的试样的那部分变得更加明显。 确切的数量和类型的过滤来优化这种效果,必须通过实验来确定。

减轻污渍颜色,或以补偿过染色的样品,具有相同颜色的污垢,应插入显微镜光路中的过滤器。 图6(c)示出了椴木茎感染了真菌禾柄锈菌的重染色薄切片。 色斑是这么厚的喷发脓包的细节模糊,但这个伪像在图6(d)加入含有相同的吸收特性作为脓包滤波器补偿。 在这种情况下,减轻污渍有助于降低图像的对比度和揭示了过多污垢被掩盖了细节。

通过使用过滤器采用对比度控制,应谨慎对待。 最终的图像取决于双方的适当选择滤波器和一个判定哪些试样的部分应调整。 反差太大可能使局势恶化,而太少的对比结果往往缺乏足够的细节图像是有用的。 我们建议广泛的实验通过观察滤波器到位试样并通过比较滤波器的传输和污渍吸收特性。 通常,结果是可以通过将不同的过滤器入光路,直至达到最佳的对比度实现加以改进。 黑白胶片是价格相对便宜,所以测试各种过滤器通过将全色片尽可能多地获得的结果。

柯达彩色滤光片圈(图7)包含有关开始使用全色胶片对比度调节点的信息。 选择彩色滤光片时,以提高样本的对比度和背景区分重要的细节,此图应作为指导。 因为染色的颜色和其可见吸收光谱有很大的不同,最终的过滤器的选择将取决于样品和污渍或污垢的混合物时。 全色感光乳剂,会有不同的反应,以红,绿,蓝三种光,并应记录重​​要数据之前进行彻底的测试。 在一般情况下,一个黄绿色滤光器,如柯达号码11,应使用以建立正确的灰度色调乘法染色标本。 当使用日光照明(氙气灯或光闪光管),插入一个黄色8号过滤器,以补偿这种色温较高比例的蓝色光存在的。 有些全色薄膜具有高灵敏度的红色,应该用13号滤波器钨卤素灯照明或11号过滤器日光照明使用。 应当提到,这些过滤器是专门用于黑白显微摄影,并不能与彩色胶片使用。在表3中列出的滤波器的建议提供在选择过滤器的对比度增强的起点。

建议过滤器/染色组合
污点 对比筛选
  蓝色 绿色 青色 黄色
Orange G - x - - - -
Azocarmine G - x - - - -
Eosin - x - - - -
Acid Fuchsin - x - - - -
Hematoxylin - x - x x -
Aniline Blue - x - x x -
Methylene Blue - - - x x x
Prussian Blue - - - x x x
Toluidine Blue - - - - x x
Trypan Blue - - - - x x
Light green SF - - - x - -
Congo Red - - x - - -
Neutral Red x x x - - -
Nigrosin x x - - - -
表3

偶尔,防污组合抗蚀剂的尝试,以产生样品的细节和背景之间的足够的对比度。 这发生在两个污物的颜色也有类似的亮度值和过滤器是用来调整显微镜的照明色温为黑白电影。 固化是要找到一个过滤器,将吸收的一种颜色几乎完全而部分吸收了其他颜色,这样既将有与背景对比度好。

因为生物染色剂的颜色可以根据试样而异,但并不总是可能推荐一个特定的过滤器,即使当在染料的光谱特性是已知的。 考虑一个青紫色斑状结晶紫,发送两个红色和蓝色波长。 使用Kodak雷登23A浅红滤波器与该染料将允许一些红色波长的要被发送的,但过滤器将不能完全消除颜色从染料。 类似的结果可以得到其它常见红色滤光片包括雷登数字24,25,和26。 然而,所有的常见的红色过滤器将彻底从一个纯粹的蓝色染料如甲苯胺蓝吸收波长。 万一结晶紫,深绿色滤光片(雷登编号58)可能是用于对比度增强的最佳选择。 添加一个过滤器,光路后,一定要检查继续进行显微摄影之前,通过目镜观察样品对比。

除了对比度控制,过滤器可以被用来克服光学象差,提高图像的分辨率。 显微镜物镜不同样良好地校正光学象差,在整个可见光光谱。 在黑色和白色显微摄影,过滤器可以被用来利用光谱那里的物镜具有最佳性能的那一部分,从而提供最佳的图像质量。 消色差物镜是在光谱的波长约550纳米为中心的绿色部分校正光。 在显微镜的照明可以通过增加绿色滤波器具有窄带宽的光路径(之前的样品)取本校正因子的优点进行调整。柯达雷登滤波器数字58,61或99可用于显微镜光的带宽限制在500-600纳米区域,以便使用消色差物镜时优化显微摄影。 的带宽可以进一步通过加入黄滤光(柯达数字15或类似的)的限制。 萤石和复消色差的物镜是更好的色差修正,不会大幅从黑白单色显微摄影照明中受益。

过滤器还可以帮助产生适度增加分辨率时照明的带宽只利用最短的可见光波长,它趴在380-400纳米的区域。另外一个柯达数字47B蓝色滤光片在显微镜光路的波长限制传递到标本的400和470纳米之间。 在光学显微镜,点至点的分辨率是根据下式计算:

R(分辨率)=λ/(2NA)

其中,R是两个结构元件之间的最小可分辨距离,λ是照明光的波长,NA是物镜的数值孔径。 从这个等式中,很明显,分辨率是成正比的光的波长。 更短的波长导致较低的R值,从而以更高的分辨率。 使用这个公式,可以计算出该数值孔径等于0.9的一个目的,分辨率将是0.39微米,对于红光(700纳米),0.31微米为绿光(550纳米),和0.22微米为蓝光(400纳米)。 因此,为了达到最大的分辨率,而不管光学矫正为目的的程度,该显微镜还可以添加蓝色滤光片的显微镜光路中。

在图8中呈现的显微照片示出了分辨率增强的使用带有过滤器的黑白显微摄影产生单色光的影响。 压缩盘的表面上的微型护堤采用柯达技术潘胶片拍摄和100倍的平场消色差的反射光与武警在3200K色温。左边的显微照片(图8(a))是钨 - 卤素照明操作在不过滤从照明源只利用白光。 在右侧(如图8(b))是具有柯达数字47B插入到光路径(蓝色)滤光器制成的显微照片。 注意护堤的增加的清晰度和锐度时由滤光器透射的蓝色光照明。

过滤器的黑白显微摄影可以是一样重要,因为那些需要在显微摄影的色彩正确的色彩还原。 当执行与黑白胶片关键工作,时刻关注乳液的特性(它们发布在网络上,或陪膜包装),并把它们作为起点的过滤器选择指南。 通过仔细地选择合适的彩色滤光片的黑白显微摄影,任何显微镜可以产生呈现足够的对比度和显示有关标本的重要细节出色的黑白图像。